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第6周-星期一Lecture Notes-大豆肽与基因的相互作用


Lecture Notes

大豆肽与基因的相互作用
祁 鸣(细胞生物学与医学遗传学系) 2014/03/31
食物中的生物活性分子能够影响生理和基因的表达,从而与慢性病的发病率和严重性 之间密切相关。膳食中的分子通过主要或次要的新陈代谢的改变直接或间接的影响基因的 表达。食物中的某些组分可以通过以下途径起作用: (1)作为转录因子的配体, (2)作为信号传导路径中的正性或负性的催化剂 (3)作为细胞核受体的配体。 化学预防剂(Chemopreventive agent): 一种通过阻断有害的生物反应或过程从而防 止疾病发生的化学成分、药物或食物补充剂。 1. 露那辛(lunasin)的结构和功能 露那辛是一个最近从大豆 2S 白蛋分离出来的由 43 个氨基酸组成大豆多肽。其羧基末 端包含一个染色体结合区域,该区域是一个细胞黏附模序 ( 精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸 (RGD))跟随着八个天冬氨酸残基组成。该染色质结合区包含 10 个氨基酸,呈螺旋排列, 与其它染色体结合蛋白中发现的小保守序列同源。 露那辛也可从大麦中分离得到。 露那辛可能在动物及哺乳动物细胞影响细胞周期调控。 -转染露那辛基因到哺乳动物细胞中,会导致有丝分裂停滞,随后细胞凋亡。 -露那辛有优先结合去乙酰组蛋白 H4 的能力。如果露那辛的多天冬氨酸尾部被切断, 它与去乙酰组蛋白 H4 结合就会减少,然而用 RGD 模序(lunasin-GRG)替换,却不会 减少它与去去乙酰基组蛋白 H4 的结合。 化学预防剂作用: - 当 外 源 露 那 辛 增 加 到 纳 摩 尔 浓 度 时 , 能 显 著 抑 制 化 学 致 癌 物 质 DMBA 诱 导 C3H/10T1/2S 鼠胚胎成纤维细胞的集落形成。 -应用能够抑制雌性致癌因子敏感鼠中皮肤肿瘤发生。 -在组蛋白去乙酰酶抑制剂、丁酸钠存在时,用露那辛处理人类 C3H/10T1/2S 和 MCF-7 乳腺癌细胞,可以观察到在乙酰化作用的核心组蛋白 H3 和 H4 的 10-95-折叠的减少, 影响致癌作用基因的表达。 -在 E1A 转染的鼠成纤维细胞 NIH 3T3 中,露那辛抑制成纤维细胞集落形成。E1A 是 一个病毒肿瘤蛋白,可以使 Rb(成视网膜细胞瘤)肿瘤抑制因子停止活动。 2. 露那辛(lunasin)对前列腺癌的治疗作用及对基因表达谱的影响 前列腺癌是美国最常见的非皮肤病类癌症,在 2003 年大约有 220900 新病例和 28900 死亡,是美国男性第二大死因。 生物芯片分析技术已经成为一种有力的检测工具,它可以同时检测到成千上万个基因 在不同水平的表达变化。cDNA 生物芯片可以用来分析抗癌药物对前列腺细胞株基因表达 谱的影响。 生物芯片分析技术 DNA microarrays: created by robotic machines that arrange minuscule amounts
of hundreds or thousands of gene sequences on a single microscope slide. Researchers have a database of over 40,000 gene sequences that they can use for this purpose. When a gene is activated, cellular machinery begins to copy certain segments of that gene. The resulting product is known as messenger RNA (mRNA), which is the body's template for creating proteins. The mRNA produced by the cell is complementary, and therefore will bind to the original portion of the DNA strand from which it was copied.

To determine which genes are turned on and which are turned off in a given cell, a researcher must first collect the messenger RNA molecules present in that cell. The researcher then labels each mRNA molecule by using a reverse transcriptase enzyme (RT) that generates a complementary cDNA to the mRNA. During that process fluorescent nucleotides are attached to the cDNA. The tumor and the normal samples are labeled with different fluorescent dyes. Next, the researcher places the labeled cDNAs onto a DNA microarray slide. The labeled cDNAs that represent mRNAs in the cell will then hybridize – or bind – to their synthetic complementary DNAs attached on the microarray slide, leaving its fluorescent tag. A researcher must then use a special scanner to measure the fluorescent intensity for each spot/areas on the microarray slide.

生物芯片分析检测非肿瘤基因型(RWPE-1)和肿瘤基因型(RWPE-2)的暴露于合成 露那辛( lunasin ) 24 小时后的前列腺上皮细胞株基因表达谱的变化,证实了露那辛 (lunasin)化学性预防作用 。暴露于 2μ M 的露那辛(lunasin)24 小时后,在 14,500 个已检查的基因中,有 123 个基因的表达水平改变超过两倍。在这 123 个基因中,121 个 基因在 RWPE-1 型细胞中表达上调,只有 2 个基因在 RWPE-2 型细胞中表达上调。给予 2 μ M 露那辛(lunasin)后,没有基因在非肿瘤基因型或肿瘤基因型表皮细胞中表达下调。 在 RWPE-1 型细胞中,上调的基因包括那些控制抗瘤作用、细胞凋亡和细胞分裂的控制。 露那辛(lunasin)上调表达的细胞凋亡基因:
细胞凋亡(英语:apoptosis,源自希腊语:απ?πτωσι?,有堕落,死亡之意),为一种细 胞程序性死亡。相对于细胞坏死(necrosis ),细胞凋亡是细胞主动实施的。细胞凋亡一般由 生理或病理性因素引起。

THBS1:在癌症细胞的凋亡或程序性死亡中有重要作用。THBS1 通过活化细胞凋亡 蛋白酶细胞死亡途径、或减少来抗细胞凋亡基因 bcl - 2 表达而诱导细胞凋亡。此外, THBS1 也有抗血管生成的能力。 BNIP3 基因:能够抑制 BCL-2 基因的抗细胞凋亡功能。BNIP3,过去称为 Nip3,是 一种能够活化凋亡作用而同时抑止 BCL-2 活性的线粒体蛋白。 BNIP3 调节与凋亡无关的 类坏疽样细胞坏死,例如细胞色素 C 释放、细胞凋亡蛋白酶的活化和凋亡诱导因子的细胞 核迁移。有证据显示,BNIP3 通过开放线粒体通透性转换孔,导致线粒体失去功能,破坏 了线粒体膜,最终导致细胞死亡[38]。 缺氧诱导因子-1α (HIF-1A) :一个基本的螺旋-环-螺旋转录因子,能调节 BNIP3 的 表达。BNIP3 启动子包含一个功能性的 HIF-1A 反应元件,缺氧或者 HIF-1A 的被迫表达都 能被激活。 HIF-1A 可以与一种抑癌基因 p53 结合和稳固。 PRKCL2,也称为 PRK2,通过抑止致癌基因 Akt 的抗凋亡活性来促进凋亡。Akt 通过 磷酸化一种可以诱导凋亡的 BCL-2 家族蛋白 BAD,减弱其活性,来实现它的抗凋亡效应。 然而,于凋亡早期产生的 PRKCL2 C 端片断结合 Akt,导致了对 Akt 介导的磷酸化 BAD 的 抑制,从而使凋亡得以发生。

露那辛(lunasin)上调表达的抑制细胞增殖的基因 PRKAR1A 基因: 该基因编码环腺苷酸依赖的蛋白激酶 A 型 I-α 的调节亚基, 一个肿 瘤抑制因子。PRKAR1A 的突变会引起 Carney 综合征(CNC) ,Carney 综合征是一种常 伴有甲状腺肿瘤的多肿瘤综合症。PRKAR1A 突变细胞下调了基因表达的控制,导致环腺 苷酸信号通路的活化以及不正常的生长增殖。 BTB(POZ): 该基因包含功能域 1(ABTB1 或者 BPOZ) ,是肿瘤抑制基因 PTEN 生 长-抑制信号通路中的介质之一。PTEN 基因的失活在人类癌症包括前列腺癌中是很常见 的。过表达 BPOZ 可抑制细胞周期进程和癌症细胞的生长,而转染 BPOZ 基因反义链则可 以加速细胞的生长。 TOB(也被指作 Tob1) :Tob 是抗增殖 BTG/Tob 家族中的一员, Tob 缺陷小鼠易于自 发生成肿瘤。 ERBIN :可与 erbb2 基因相互作用的蛋白,是新型的 Ras 信号抑制剂。ERBIN 是一 个富含亮氨酸的蛋白质,它与 Ras 相互影响,又可干扰 Ras 与 Raf 之间的相互作用, 导 致 Ras 介导活化的细胞外信号调控激酶(Erk)负调节。Ras 致癌基因在大约 30%的人类

癌症中是最常见的突变发生。Ras 突变导致组成型活化,产生连续性的信号,不管细胞表 面的受体是否被生长因子活化,这个信号都会通知细胞生长。

露那辛(lunasin)上调表达的有丝分裂关卡基因
有丝分裂关卡(mitotic checkpoint): 也称纺锤体关卡(spindle checkpoint),是监控细胞有丝分 裂期纺锤体形态与位置、着丝点与来自纺锤体微管连接状况、染色体位置和排列的监控机制 ;在 有丝分裂关卡的监控下,只有当所有染色体都与来自纺锤体两极的微管连接并排列于赤道板上时, 细胞才由有丝分裂期中期向后期转换,走出有丝分裂期。

露那辛( lunasin)上调的其他基因包括有丝分裂关卡基因,如 BUB1B ( BubR1) 、 TTK 蛋白激酶(酵母 MPS1 的一个同族体)和 。有丝分裂纺锤体关卡蛋白在有丝分裂进 程中监控特定的微管结合到染色体中,允许染色体进入到子细胞中的正确分离。 TTK 蛋白激酶:酵母 MPS1 的一个同族体,磷酸化 MAD1p,是有活化丝分裂关卡的必 要步骤。酵母细胞纺锤体组装关卡早期需要 MPS1 。它是活化有丝分裂关卡过程中限制性 的一步,因为当过表达 MPS1 时,细胞分裂的途径就被激活了。过表达 MPS1 可以延迟细胞 周期进程进入分裂后期,破坏纺锤体形。MPS1 也是用于纺锤体极体复制过程中的一个重要 物质。 BUB1B(BubR1) :BubR1 是关卡控制所需的蛋白激酶。 通过显微注射特定的抗体使 BubR1 失活能够破坏细胞分裂关卡的控制。 某些乳腺癌细胞株中内源性的 BubR1 蛋白水平 下降。 乳腺癌特异基因 1(BCSG1)编码的致癌蛋白可直接与 BubR1 交互作用,导致 BubR1 经由蛋白酶体部件降解,使乳腺癌发生,这个过程至少部分是由 BubR1 失活改变有丝分裂 关卡造成的。 MAD2L1 (有丝分裂阻滞缺陷二型蛋白 1 ):人乳腺癌细胞株中另一个关卡基因 MAD2L1 表达减弱,表现为染色体不稳定且易形成非整倍体。一些乳癌细胞株携带 MAD2L1 基因位点突变,形成一种截短蛋白产物。 露那辛(lunasin)上调这些有丝分裂关卡基因,从而提高了分子监控能力,阻止细胞 过早分裂、染色体不稳定和形成非整倍体。

露那辛(lunasin)上调表达的蛋白降解相关基因 蛋白酶体 26S 亚体 ATP 酶 6(PSMC6) E3 泛素连接酶(SMURF2) 泛素特异性蛋白水解酶(USP1) 泛素活化酶 E1C(UBE1C) 露那辛(lunasin)上调这些基因,从而调节蛋白的降解,这些蛋白在细胞的转换和集 落的形成的起始阶段是需要的。

露那辛(lunasin)上调表达的间隙连接蛋白基因 细胞间隙连接通讯(gap junction intercellular communication, GJC): 邻近细胞 之间通过允许小分子通道的间隙连接通路交流信息,间隙连接通路是由叫做连接蛋白的蛋 白质组成的。 GJC 在许多癌症细胞中被阻断,例如人类恶性前列腺癌细胞。 连接蛋白 43: 此蛋白已显示出有抑制肿瘤的作用。在多个前列腺肿瘤细胞株中都发现 了连接蛋白 43 表达减少及转录后修饰受损,表明阻断间隙通讯是人类前列腺癌进程的关键 性一步。 病毒致癌基因 Src 通过将连接蛋白 43 的酪氨酸残基增加一个磷酸基团,阻断间 隙连接通讯,从而使细胞生长失控。转染功能性连接蛋白 43 基因到肿瘤性小鼠细胞后可以 修复 GJC、正常生长调节、细胞与细胞之间的信息交流以及对肿瘤的抑制。

3. RT-PCR 技术验证芯片分析结果 在 mRNA 水平上,使用实时荧光定量 PCR 技术(RT-PCR)验证基因芯片分析所发现 露 那辛上调的 4 个基因,即凝血酶敏感蛋白 1(THBS 1) 、cAMP 依赖性蛋白激酶调节亚单位

类型α 1(PRKARlA)、ERBB2 传导器 1(TOBl)和低氧诱导因子 1α 亚基(HIF 一 1A)。选择这 4 个基因是因为它们代表了细胞凋亡和增殖途径中的基因。RT-PCR 对这些选定基因的分析 结果与生物芯片数据(数据没有展示)的结果是一致的。这些结果支持对于生物芯片数据 的解释,即露那辛(lunasin)能够上调正常前列腺上皮细胞的基因表达,而不是已经形成 的恶性肿瘤前列腺上皮细胞。

总结 生物芯片数据显示,露那辛(lunasin)上调的基因主要包括以下几类:有丝分裂关卡 基因、肿瘤抑制基因和促进细胞凋亡基因。这表明露那辛(lunasin)直接或者间接作为基 因的转录活化因子来阻止正常细胞转化为肿瘤细胞。 露那辛(lunasin)通过阻止乙酰化去 乙酰组蛋白 H3 和 H4 使正常细胞转化为肿瘤细胞。阻止这些组蛋白乙酰化会导致染色质浓 缩和癌症基因转录失活。 为了研究露那辛(lunasin)对所有基因表达的影响,对非肿瘤 基因型 (RWPE- 1) 和肿瘤基因型 (RWPE- 2) 前列腺上皮细胞做生物芯片分析。 用露那辛 (lunasin)预处理 C3H/T101/2 细胞 24 小时上调了化学预防基因的表达,从而保护了细 胞免于被 DMBA 和 MCA 诱导转化。但露那辛(lunasin)对 RWPE-2 即前列腺上皮细胞 的肿瘤基因型细胞株的基因表达几乎没有影响,推测很可能是因为这些致瘤细胞不能像 RWPE-1 细胞那样有效地结合或者内化露那辛(lunasin) 。如细胞膜上整合素受体的存在 或缺失将决定一个小的多肽例如露那辛(lunasin)能否进入细胞。 除了露那辛(lunasin)以外,几个其它的大豆化合物已被认为是抗癌活性物。例如, Bowman-Birk 抑制剂(BBI),一种源于大豆的丝氨酸蛋白酶抑制剂,无论在体内还是体外系 统中都显示具有抗癌活性。露那辛(lunasin)对正常和癌症细胞都没有细胞毒性,而 BBI 和 BBIC(一种富含 BBI 的大豆浓缩物)则不同,它可以抑制前列腺癌细胞株的生长、入 侵和克隆存活。BBI 和 BBIC 抑制效应的精确机制目前正在研究中。另一个从大豆中提取 的化学性预防活性物质是染料木黄铜,它是大豆中主要的异黄酮。我们发现染料木素在体 内和体外都可以抑制癌症基因,而且它还可以抑制核转运因子 NF-κ B 和 Akt 信号通路的 活性,这二者都可用来维持细胞生存和凋亡之间的平衡。有证据显示,染料木黄铜通过上 调 BAX 来诱导凋亡,BAX 是一种对抗 Bcl-2 抗凋亡功能的蛋白质。用染料木黄铜处理过 的 PC3 前列腺癌细胞,通过生物芯片分析发现它的基因表达谱有 774 个基因表达下调, 有 58 个基因表达上调。与露那辛(lunasin)的效果相似,染料木黄铜改变的主要是细胞 生长、细胞周期、细胞凋亡、细胞信号转导、血管生成、肿瘤细胞入侵和转移中的基因表 达。与 BBI 和染料木黄铜相比,露那辛(lunasin)对转化后的前列腺癌细胞没有或很小的 抑制作用,这在我们的生物芯片数据中得到证实,数据显示,前列腺癌细胞只有 2 个基因 (排列有 14,500 个基因)的表达上调。这些基因是胶原蛋白,V 型和溶酶体相关的膜蛋 白 1。 还有其它的小多肽也被报道具有防治癌症作用。Ellerby 和他的同事设计了 21-26 个 氨基酸的多肽,这些多肽对血管内皮细胞具有选择性毒性,而且对小鼠具有抗癌活性。有 趣地是,露那辛(lunasin)和这些多肽有两个惊人的结构相似。和露那辛(lunasin)一样, 这些多肽在它们的“主结构域”具有细胞结合模序(RGD 或者 NGR) ,而在它们的促凋亡 区段则有一个短的螺旋状片段。然而,不同于露那辛(lunasin) ,这些多肽不具有负向调 节尾巴。这些确定的凋亡多肽展现了抗癌治疗的新前景。 露那辛(lunasin)对人类基因表达的选择性效果支持了一个广泛的流行病学证据,即 多食大豆和降低某些肿瘤的发病风险有关,如乳癌、前列腺癌及大肠癌。 露那辛(lunasin)是转录活化因子和/或组蛋白乙酰化的抑制剂,它的这些显著性作用 仍需进一步研究。露那辛(lunasin)很可能间接通过改变细胞内 NAD 内稳态和能量平衡 来影响化学预防基因的转录活性。 NADH 再氧化与线粒体电子传递活性有关,而且 NAD 是染色质重塑过程中组氨酸去乙酰化的辅因子。染色质重塑(例如组氨酸乙酰化和去乙酰 化)对基因调控有短期或长期的影响。露那辛( lunasin )上调了基因的表达,影响了 NAD 的内稳态,这提供了露那辛(lunasin)的化学预防作用与先前描述的抑制组氨酸乙酰 化作用之间的关联。 对于露那辛(lunasin)的研究,有助于阐明它在转录、逆转录、翻译后和基因组水平

中如何影响化学预防基因的表达。以下几个问题仍需进一步的研究:
1. 露那辛(lunasin)化学预防作用特征的确切机制是什么? 2. 露那辛(lunasin)是单独起效,还是与细胞中的其它蛋白质联合作用来上调基因的表达? 3. 露那辛(lunasin)在哺乳动物细胞中结构是否改变(比如磷酸化)?这些结构的改变对于化学预 防作用是必需的么? 4. 为什么露那辛(lunasin)对前列腺癌细胞无效? 5. 在人类基因中,是否有基因的突变(例如 SNPs)可以影响露那辛(lunasin)与细胞中其它化合 物的相互作用?

基于饮食干预,更好地理解了露那辛(lunasin)如何与哺乳细胞及细胞中的化合物相 互作用,将使得化学预防作用更有效。


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