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miR-22,199原位杂交流程


miR-22,199 原位杂交流程 一、操作流程
1、常规石蜡切片(4μm)脱蜡至水; 2、PBS 洗 3×3min; 3、柠檬酸盐 98℃ 15min; 4、5μ g/ml 蛋白酶 K 37℃ 5min,PBS 洗 3×3min。 5、0.1mol/L 甘氨酸 PBS 洗 10min. 6、0.25%乙酸酐的 0.1mol/L 三乙醇胺(pH8.0)洗 10min,PBS 洗 10min。 7、预杂交 0.2×SSC+50%甲酰胺 60min 37℃。

8、杂交:每片滴加 30μ l 杂交液(每 ml 杂交液含锁探针 15ul,约 1.5pM)用干净的盖玻 片复盖,95℃变性 8min,立即将切片置于冰上复性,55℃杂交过夜(约 18h)。 9、杂交后洗: ⑴用 60℃5×SSC 洗去盖玻片(洗下盖片即可,约 5min); ⑵0.2×SSC 洗 短暂 室温; ⑶0.2×SSC 洗 60℃中温育 60min; ⑷滴加阻断试剂,并孵育 10min; 10、免疫组织化学检测: ⑴3%H2O2 阻断内源性过氧化物酶 室温 10min; ⑵滴加 McAb 抗 Dig IgG 一抗(REF/Cat.No.84-0146,lot#:305359;invitrogen 公司产品) 37℃ 30min; ⑶PBS(内含 0.05%Tween20)洗 3×3min ⑷羊抗鼠-HRP 多聚物酶标二抗(REF/Cat.No.84-0150,lot#:651671A;invitrogen 公司) ⑸PBS(内含 0.05%Tween20)洗 3×3min; ⑹0.04%DAB+0.05% H2O2 10-30min; ⑺Mayer’s 苏木精轻微复染,显色完成后流水终止反应 ↓1%盐酸酒精 10 秒分色 ↓自来水冲洗 5 分钟×2 次 ↓氨水溶液 30~60 秒 ↓自来水冲洗 3~5 分钟。

脱水、透明、封片

二、议器设备
1、冰箱 海尔 BCD-256KFD 2、隔水式恒温孵育箱 GNP-9080 青岛 上海精宏实验设备有限公司 德国 LEICA 公司 德国 LEICA 公司 德国 LEICA 公司

3、切片机 LEICA RM2145 4、展片机 Leica HI1210 5、烤片机 Leica HI1220 6.、水浴锅 7、杂交炉 Biometra Compact Lin OV04

三、试剂和探针
(一)探针 1、miR-199? Dig 标记的核酸锁探针 合成于 Exiqon
公司

Gene ID: MI0000242 GCCAACCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGAGGCUCUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGGC 2、miR-22 Dig 标记的核酸锁探针 合成于 Exiqon
Gene ID: 公司

MI0000078

GGCUGAGCCGCAGUAGUUCUUCAGUGGCAAGCUUUAUGUCCUGACCCAGCUAAAGCUGCCAGUUGAAGA ACUGUUGCCCUCUGCC
Exiqon 公司生产的 MiRCURYTM 原位杂交检测探针具有高度的亲和活性和高超的碱基错配识别能力,无论是组织 切片、细胞,或是经过甲醛固定、石蜡包埋的标本,都能精确检测其中的 miRNAs。LNA 是高亲和力的核酸拟似物,它能 够显著提高 DNA 寡核苷酸的杂交效率。Exiqon 合成的原位杂交检测探针运用了掺入 LNA 的设计(约掺入 30%LNA) ,每融 合一个 LNA 能够使 DNA/RNA 杂交的 Tm 值升高 2-10 度。Tm 值的升高能增强 LNA-DNA/RNA 双链的稳定性,使即使 20nt 的 短探针也能拥有较高的 Tm 值(70 度以上) ,以满足严格杂交条件下的原位杂交实验。 MiRCURYTM 原位杂交检测探针主要优点: ? ? ? ? ? 高灵敏度,可以检测普通 oligo 探针检测不到的微量 miRNAs。 覆盖所有已知的 miRNAs。 高特异性,能够区分单碱基或 2 个碱基差异的 miRNAs。 适应多种标记方法,如 DIG、生物素、荧光。 提供完整的实验步骤。


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