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MIR-145通过靶向EGFR和NUDT1抑制人肺腺癌细胞增殖


MIR-145 通过靶向 EGFR 和 NUDT1 抑制人肺腺癌细胞增殖 参考文献:William c.s. cho,* Andrew s.c. chow and Joseph s.K. Au. MiR-145 inhibits cell proliferation of human lung adenocarcinoma by targeting EGFR and NUDT1. RNA Biology 8:1, January/February 2011, 125-131. 摘要: 小 RNA(miRNA)是新兴的具有重要调节功能的 RNA,它们的出现在肿瘤 发生中也发挥着关键作用。 MIR-145 在几种人类恶性肿瘤中表达下调,包括肺 癌,但其分子机制仍不清楚。我们曾报道过,hsa-miR-145 能够抑制癌细胞的生 长,对于表皮生长因子受体(EGFR)突变的肺腺癌患者。这项研究表明, hsa-miR-145 针对肺腺癌细胞 EGFR 和二磷酸核苷相连部分的 X- 1(NUDT1 或 MTh1) 。EGFR 和 NUDT1 的 mRNA 表达对人肺腺癌细胞的 miR-145 转染后显著下 调。 我们的研究结果证实了 miR-145 对 EGFR 和 NUDT1 表达无论是在 mRNA 还是 蛋白水平都是负调控。进一步分析发现,miR-145 在这三个时间点(24,48 和 72 小时) ,具有抑制转染肺腺癌细胞的细胞增殖能力。miR-145 的上调似乎是肺 腺癌细胞增殖的重要基因调控机制,它与 EGFR 和 NUDT1 的下调密切相关。有趣 的是,我们的研究显示,改变肺癌细胞的增殖不伴随细胞凋亡的变化。我们的发 现提供了新的对复杂的调节通路的深刻理解,包含 miR-145,EGFR,NUDT1 和其 他对细胞增殖而不是细胞凋亡的未知因素, 。了解 miR-145 的作用靶点及其调控 通路可能产生对肺腺癌新的治疗策略。 方法: 1,细胞转染 miR-145 或 miRNA 阴性对照 miR-145 表达载体(miRNASelect PEP-的 miR-145)和 miRNA 的阴性对照载体 (miRNASelect PEP-MIR 空控制)购自 Cell Biolabs 公司(圣地亚哥,CA 获得 美国) 。所有肺腺癌细胞系根据制造商说明(QIAQEN,德国希尔登)使用双倍体转 染试剂转染 PEP-miR-145 或 PEP-MIR-null。 除非另有说明, 1 微克 DNA 载体在 100 微升缓冲液稀释混合加 8 微升增强剂温育 2 分钟。 将 5 微升的双倍转染试剂加入 到 DNA 的增强剂混合物中,并温育 10 分钟,使转染复合物形成。在复合物形成 期间,用含有 10%(V / V)FCS 的 2.5 毫升不含抗生素的培养基代替正常生长所 用的培养基。然后将转染复合物施加到细胞,并培养 72 小时。转染 72 小时后, 用 qRT-PCR 分析转染效率。 2. RNA 提取和 mRNA 与 miR-145 的定量 RT-PCR 分析 根据制造商的说明,使用 Trizol 试剂盒(Invitrogen 公司,卡尔斯巴德,CA USA) 提取肺腺癌细胞中总 RNA。采用实时定量 RT-PCR 获得的 miR-145 转染后表达的 准确定量。简言之,使用 TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒(Applied Biosystems 公司,福斯特城,CA USA)从总 RNA 样品(10 毫微克)逆转录得到 cDNA。每个 miRNA 反转录(RT)反应包括 RT 缓冲液,1mM deoxynu-核苷酸三磷酸,5 个单 位的 MultiScribe 反转录酶(Applied Biosystems) ,核糖核酸酶抑制剂和 RT 引物。 将反应管在 16℃下培养 30 分钟,42℃下培养 30 分钟,85℃下进行 5 分钟,最 后 4℃培育 5 分钟。RT 产物取 20ul 进行 PCR,反应条件为 95℃ 10 分钟,接着 进行 95℃ 15 秒,60℃60 秒达 40 个循环。标准化的数据为 TaqMan 内源性控制 RNU48 仪(Applied Biosystems)的表达。miR-145 的相对定量表达水平通过 C T 法来测定,分析 mRNA。 3.免疫印迹分析 用裂解缓冲液将所有转染肺腺癌细胞进行裂解 (50 毫摩尔 Tris 盐酸, pH 值 7.5;150 毫摩尔 NaCl,用 1%的 Triton X-100;0.1%十二烷基磺命运;0.25%的脱氧胆酸钠)

缓冲液中含有蛋白酶抑制剂混合物(Sigma 公司-Aldrich 公司,圣路易斯,密苏里 州美国) 。蛋白浓度通过 BCA 蛋白质测定试剂盒(Pierce 化学公司,罗克福德, IL USA)定量。简言之,用 4-12%的 Bis-Tris 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶 电泳分离并印迹至 0.2μ m 的硝酸纤维素膜,分离细胞裂解物蛋白(15 微克) 。 印迹固定室温 2 小时, 然后在 4℃与每个初级抗体孵育过夜[抗 EGFR, 抗 NUDT1, 抗聚 ADP-核糖聚合酶(PARP)接着二抗孵化,通过柯达影像站进行蛋白质检 测和定量。用 Western 印迹回收试剂盒(微孔公司,比尔里卡,MA USA)进行 印迹剥离,以重新探测不同的抗体。 β 肌动蛋白用作上样对照。 4.细胞增殖分析。 根据 CellTiter 96 AQ ueous 水性单溶液细胞增殖试验测定细胞增殖(Promega 公 司,麦迪逊,WI USA) ,甲臜产物的量与培养的活细胞的数量成正比,简言之, NCI-H1975 细胞(0.6×105)接种到 24 孔板的每个孔中,并在 37℃下在 5%CO 2 的潮湿培养箱保持在正常生长培养基中 24 小时。 当细胞达 70%, 将它们与 miRNA 的载体进行转染。 A 0.2 微克载体 DNA 在 60 微升 extracel-与 1.6 微升增强剂混合, 并温育 2 分钟细胞性缓冲液稀释。 2 微升的双倍转染试剂 (QIAQEN) 加到该 DNA 会混有增强剂的混合物中温育 10 分钟, 形成转染复合物。 在复合物形成过程中, 用含有 10%(V / V)FCS 的 0.5 毫升不含抗生素的培养基代替正常生长培养基。 然后将转染复合物加入到细胞中并在转染后 24 小时,48 小时和 72 小时收集样 品。在每个时间点,细胞存活率使用 MTS 测定试剂盒(Promega 公司)进行评 估。将 MTS 试剂加入到培养基(1/5 稀释)并在 490nm 波长测定吸光度 OD 值。 5. 生物信息学分析和 HSA-miR-145 目标预测


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