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miR-195对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响


中国组织工程研究 第 20 卷 第 45 期

2016–11–04 出版
November 4, 2016 Vol.20, No.45 www.CRTER.org

Chinese Journal of Tissue Engineering Research

·研究原著·

miR-195对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
宋 鹏,荆 凯,薛建华,魏鹏飞(河南省中医院,河南省郑州市 450002) 引用本文: 宋鹏,荆凯,薛建华,魏鹏飞 . miR-195 对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响 [J]. 中国组织工程研究, 2016 , 20(45):6693-6699. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.45.001 文章快速阅读:
miR-195 对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
宋鹏,男,1975 年生, 河南省郑州市人,汉族, 2001 年郑州大学临床医 学院毕业, 硕士, 主治医 师,主要从事创伤骨科、 手足显微外科的研究。
中图分类号:R394.2 文献标识码:A 文章编号:2095-4344 (2016)45-06693-07 稿件接受:2016-09-19

ORCID: 0000-0001-7370-8200(宋鹏)

体外分离、培养人骨髓间充质干细胞

通过脂质体转染构建 miR-195 低 表达的人骨髓间充质干细胞 结论: miR-195 通 过 靶 向 SMAD7 促进人骨髓间 充质干细胞成骨分化。 利用荧光素酶报告基因实验检测 miR-195 对 SMAD7 的靶向作用

(1)检测人骨髓间充质干细胞诱导分化 过程中碱性磷酸酶活性和骨分化特异 基因 Runx2 和 osteopontin 表达; (2)miR-195 和它的潜在靶 SMAD7 表 达。

文题释义: 微小 RNA(miRNA):是近几年来发现的一类长度为 21-25 bp 的内源性非编码小 RNA,它们通过结合 到目标靶 mRNA 上,降解 mRNA 或阻遏翻译功能,从而在多种生物学过程中发挥重要调控作用,例如 细胞的增殖、凋亡、分化、衰老等。据预测,至少 1 000 个 miRNAs 存在于人类基因组中,调控上万 个蛋白编码基因。 生物信息学分析也表明每个 miRNA 调控成百上千个基因, 这也从侧面反映了 miRNAs 几乎参与了每一个生物学过程。 萤光素酶: 是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称, 其中最有代表性的是一种学名为 Photinus pyrali' 的萤火虫体内的萤光素酶。在相应化学反应中,萤光的产生是来自于萤光素的氧化,有些情况下反应体 系中也包括三磷酸腺苷(ATP)。没有萤光素酶的情况下,萤光素与氧气反应的速率非常慢,而钙离子的 存在常常可以进一步加速反应(与肌肉收缩的情况相似)。

摘要
背景:既往研究发现,miR-195 在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中,表达量显著增加,但是其作 用及其机制尚不明确。 目的:探索 miR-195 对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响及其机制。 方法:体外分离、培养人骨髓间充质干细胞,通过碱性磷酸酶活性测定试剂盒、蛋白免疫和实时定量反 转录 PCR(qRT-PCR)检测在人骨髓间充质干细胞诱导分化过程中,碱性磷酸酶活性和骨分化特异基因 Runx2 和 osteopontin 表达水平的变化,以及 miR-195 和它的潜在靶 SMAD7 表达量的变化;通过脂 质体转染构建 miR-195 低表达的人骨髓间充质干细胞,研究 miR-195 对人骨髓间充质干细胞成骨分化 的影响。利用荧光素酶报告基因实验检测 miR-195 对 SMAD7 的靶向作用。 结果与结论:①分离培养的人骨髓间充质干细胞具有优良的体外成骨分化能力;②miR-195 表达量随 人骨髓间充质干细胞诱导分化时间的增加而升高,SMAD7 则相反。③miR-195 能够促进人骨髓间充质 干细胞成骨分化; ④荧光素酶实验证实 SMAD7 是 miR-195 的直接靶, SMAD7 过表达抑制人骨髓间充 质干细胞成骨分化;⑤结果提示,miR-195 通过靶向 SMAD7 促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。 关键词:

干细胞;骨髓干细胞;成骨分化;miR-195;人骨髓间充质干细胞;骨质疏松;SMAD7
主题词:

骨发育;间充质干细胞;微小 RNA;组织工程

ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R

CODEN: ZLKHAH

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宋鹏,等. miR-195 对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
Song Peng, Master, Attending physician, Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450002, Henan Province, China

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miR-195 effect on osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells
Song Peng, Jing Kai, Xue Jian-hua, Wei Peng-fei (Henan Province Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450002, Henan Province, China)

Abstract
BACKGROUND: Previous studies have found that the expression level of miR-195 in differentiated human bone marrow mesenchymal stem cells (hBMMSCs) is significantly higher than that in undifferentiated hBMMSCs. However, miR-195 effect during this differentiation process and possible mechanism remain unclear. OBJECTIVE: To explore the effect of miR-195 on osteogenic differentiation of hBMMSCs and possible mechanism. METHODS: hBMMSCs were isolated and cultured in vitro. Alkaline phosphatase activity, Runx2, osteopontin and SMAD7 protein expression and miR-195 expression level during osteogenic differentiation of hBMMSCs were determined by alkaline phosphatase kit, western blot and real-time PCR, respectively. miR-195-downexpressed hBMMSCs were constructed by lipofection transfection, and were used to investigate the effect of miR-195 was on osteogenic differentiation of hBMMSCs. Dual luciferase reporter assay was used to identify whether the 3’UTR of SMAD7 mRNA was a binding target of miR -195. In addition, we transfected hBMMSCs with SMAD7 cDNA (pcDNA-SMAD7), and investigated the effect of SMAD7 on osteogenic differentiation of hBMMSCs. RESULTS AND CONCLUSION: The isolated and cultured hBMMSCs had good osteogenic differentiation ability in vitro. Expression level of miR-195 was increased with the increasing of induction time, and the expression level of SMAD7 was reversed. miR-195 promoted osteogenic differentiation of hBMMSCs. Luciferase assay confirmed that miR-195 targeted SMAD7 directly, and overexpression of SMAD7 inhibited the osteogenic differentiation of hBMMSCs. Taken together, miR-195 promotes osteogenic differentiation of hBMMSCs by targeting SMAD7. Subject headings: Bone Development; Mesenchymal Stem Cells; MicroRNAs; Tissue Engineering Cite this article: Song P, Jing K, Xue JH, Wei PF. miR-195 effect on osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(45):6693-6699.

0 引言 Introduction
间充质干细胞是位于中胚层的一类多能干细胞,在 不同条件下可以分化为脂肪细胞、 成骨细胞、 软骨细胞、 肌细胞等多种细胞
[5] [1-4]

miRNAs存在于人类基因组中,调控上万个蛋白编码基 因
[10-11]

。生物信息学分析也表明每个miRNA调控成百
[9]

上千个基因, 这也从侧面反映了 miRNAs 几乎参与了每 一个生物学过程 。越来越多的研究表明,miRNAs 能 够调控间充质干细胞向成骨细胞分化,例如 miR-346、 miR-20a、miR-29b、miR-433等
[12-15]

。它最初是由Friedenstein等从骨

髓中分离鉴定的,后发现它广泛存在于脂肪、肌肉、血 液等结缔组织中 。它还能通过细胞间的相互作用以及 产生的细胞因子来抑制B细胞、 T细胞等的增殖, 从而抑 制免疫反应,因此在临床中不存在免疫排斥 。由于人 骨髓来源的间充质干细胞易于在体外培养,且可在成骨 诱导条件下分化为成骨细胞,已成为目前较理想的骨组 织工程种子细胞,在促进骨质疏松患者骨的修复和重建 中发挥着巨大的作用 。而提高人骨髓间充质干细胞成 骨分化能力是骨再生的关键。 MicroRNAs(miRNA) 是近几年来发现的一类长度 为21-25 bp的内源性非编码小RNA, 它们通过结合到目 标靶mRNA上,降解mRNA或阻遏翻译功能,从而在细 胞的多种生物学过程中发挥重要调控作用,例如细胞的 增殖、凋亡、分化、衰老等
[8-9] [7] [6]

。近期研究发现

miR-195 在人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过 程中,表达量显著增加,但是其具体的作用和机制尚 未有报道
[16]

。作者通过 Targetscan 和 miRanda 等在线

软件预测 miR-195 靶基因,发现 Smad7 是它的一个潜 在靶。 SMAD7 是转化生长因子 β 信号通路的抑制剂, 而转化生长因子 ? 信号通路是骨形成最重要的一条信 号通路 化。 研究通过分离培养人骨髓间充质干细胞,采用成骨 分化诱导培养体系诱导其向成骨细胞分化,通过执行实 时定量PCR、免疫印迹、荧光素酶报告活性检测等实验
P.O. Box 10002, Shenyang 110180 www.CRTER.org
[17-20]

。因此,猜测 miR-195 可能通过靶向抑制

SMAD7 表达促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分

。据预测,至少1 000个

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宋鹏,等. miR-195 对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响

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探究 miR-93 在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的 作用,以及是否通过靶向调控Smad7起作用。

1.4.2

细胞转染
?

按照Trizol试剂盒使用说明提取人骨

髓 间 充 质 干 细 胞 的 总 RNA , 然 后 依 照 One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit使用说明书反 转录得到cDNA,通过PCR扩增SMAD7 cDNA,并将其 克 隆 到 真 核 表 达 载 体 pcDNA3.1 中 , 构 建 pcDNA-SMAD7重组质粒。选取对数期生长状态良好的 人骨髓间充质干细胞,以2×10 /孔的密度接种到 6孔板 中,置于37 ℃、体积分数5%CO2、饱和湿度的孵箱中 培养。待细胞生长至约50%融合时,按照Lipofectamine 2000 转染试剂盒说明书进行转染,将 miR-195 模拟物 (miR-195 mimics)和miRNA模拟物对照(miR-control)、 miR-195 抑 制 剂 (miR-195 inhibitors) 和 抑 制 剂 对 照 (anti-miR-control) , pcDNA-SMAD7 重组质粒 (pcDNASMAD7) 和对照 (pcDNA-control) 转染至人骨髓间充质 干细胞,转染 24 h后更换新鲜的培养液。待细胞融合 度为60%-70%时,更换为成骨诱导培养基诱导其成骨 分化。 1.4.3 实 时 定 量 PCR(qRT-PCR) 检 测 miR-195 表 达 收集诱导0,3,6,9,12 d的细胞,用PBS清洗3次, 加入RNAiso for small RNA提取总miRNA,用琼脂糖凝 胶电泳测其质量,分光光度计测其浓度,无RNA酶水调 整其质量浓度为1 g/L。 然后按照One Step PrimeScript
? ? 5

1
1.1 1.2 1.3

材料和方法 Materials and methods
设计 细胞分子生物学体外实验。 实验于 2014 年 8 月至 2015 年 8 月在 时间及地点 材料

河南省中医院病理实验室完成。

试剂及仪器:MEM培养基,胎牛血清(FBS),青霉
素,链霉素(美国Gibco公司);Percoll 分离液,RNAiso for small RNA(武汉科昊佳生物科技有限公司);地塞米 松,β-甘油磷酸钠,维生素C(美国Sigma 公司);U6(上 海诺伦生物医药技术有限公司 ) ; Trizol 试剂盒, One Step PrimeScript
?

miRNA cDNA Synthesis Kit ,

Lipofectamine 2000 转 染 试 剂 盒 , Dual-Luciferase Reporter System (美国GeneCopoeia 公司); SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ , GeneTailor
TM TM

Site-Directed

Mutagenesis System 试剂盒(美国Invitrogen 公司);碱 性磷酸酶活性测定试剂盒 ( 南京建成生物制品有限公 司);miR-195模拟物和miRNA模拟物对照,miR-195抑 制剂和抑制剂对照,pcDNA3.1载体(西安沃尔森生物技 术有限公司);Chromo4 实时定量PCR仪(上海智中实 验 室 设 备 有 限 公 司 ) ; SMAD7 抗 体 , Runx2 抗 体 , osteopontin抗体,GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记 二抗(英国Abcam公司)。 1.4 1.4.1 实验方法 人骨髓间充质干细胞的分离、培养和成骨诱导
TM

miRNA cDNA Synthesis Kit 操作说明进行反转录得到 cDNA, 将得到的cDNA稀释4倍, 加入SYBR Premix Ex Taq Ⅱ,以 U6 为内参基因,在 Chromo4 实时定量 PCR仪上进行定量,采用 Opticon-3 软件对结果进行分 析。 1.4.4 免疫印迹检测 用PBS清洗收集的细胞, 用细胞 裂解液、磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂按体积配比为 100∶1∶1配置的混合液裂解细胞, 冰浴30 min 后收集 上清,测定蛋白浓度,取等量的蛋白进行十二烷基磺酸 钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),并转至硝酸纤维 素膜,TBST洗涤,使用5%脱脂牛奶室温封闭 1 h,一 抗孵育4 ℃过夜,TBST洗涤3次,二抗孵育2 h,TBST 洗涤3次后,于暗室中进行压片,然后ECL化学放光及 显影。 1.4.5 碱性磷酸酶活性检测 根据碱性磷酸酶活性测 定试剂盒说明书进行,采用 ELISA 方法,用碱性磷酸 酶黄色液体底物系统对碱性磷酸酶活性进行定量。收 集细胞,提取细胞的总蛋白,以总蛋白量对碱性磷酸 酶活性进行标准化。使用紫外分光光度计测定波长 405 nm 处的吸光度值,并依照下列公式计算碱性磷酸
TM TM

经伦理委员会批准,本人签署知情同意书后,抽取健康 志愿者的骨髓,置于肝素抗凝管中。将骨髓与等体积无 血清α-MEM培养基(含有青霉素钠和链霉素各100 U/mL) 吹打混匀。室温 800×g 离心 10 min ,去除脂肪层,用 α-MEM培养液重悬细胞,缓慢注入等体积的1.073 g/mL Percoll 分离液,400×g离心30 min,吸取中间的单个核 细胞层,PBS清洗2次,重悬于含有体积分数10% FBS 及青霉素钠和链霉素各100 U/mL的α-MEM培养液中, 使 细胞浓度为1×10 L ,接种于培养瓶中进行扩大培养。 实验中所用到的间充质干细胞均为第4代。间充质干细胞 经不同处理后接种于6孔板中,待细胞生长至60%-70% 融合时,更换为成骨诱导培养基诱导其成骨分化,成骨 诱导培养基为内含有体积分数10% FBS、0.1 μmol/L地 塞米松、10 mmol/L β-甘油磷酸钠和50 mg/L维生素C 的α-MEM培养液。
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9
-1

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酶活性: 碱性磷酸酶活性(U/g)=[(测定管吸光度值/标准管吸 光度值)×标准管对硝基酚量]/总蛋白克数 1.4.6 荧光素酶实验 将 SMAD7 3 ’UTR 片段的 PCR 扩增产物克隆到 pGL3质粒 Xbal I 酶切位点,构建野生 型 pGL3-WT-SMAD7 报 告 基 因 质 粒 。 按 照 GeneTailor
TM

2.3

miR-195 促进人骨髓间充质干细胞成骨分化



了探究miR-195对人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化 影响,首先通过脂质体转染构建miR-195低表达的细胞 和对照细胞,然后诱导其分化,在分化的第9天,检测 碱性磷酸酶活性, 发现miR-195低表达组相比于对照组, 碱性磷酸酶活性明显降低(图3A)。此外,采用免疫印迹 检测两组细胞中骨分化标志物 Runx2 和 osteopontin 蛋 白的表达。结果显示miR-195低表达组相比于对照组有 明显较低的Runx2和osteopontin蛋白表达水平(图3B)。 这些结果表明了miR-195能够促进人骨髓间充质干细胞 向成骨细胞的分化进程。 2.4 miR-195 直 接 靶 向 SMAD7 通 过 Targetscan 和 miRanda等在线软件预测miR-195靶基因,发现Smad7 是它的一个潜在靶,SMAD7 mRNA的3’UTR与miR-195 的种子区存在理论上的互补碱基配对序列(图4A)。 进而执 行了荧光素酶实验,结果显示共转染SMAD7野生型的实 验组的荧光素酶活性明显低于对照组,而共转染SMAD7 突变型的实验组与对照组的荧光素酶活性无显著差异, 这 证实miR-195可以直接作用于SMAD7(图4B)。又进一步 实验,研究转染miR-195抑制剂和抑制剂对照对人骨髓间 充质干细胞中SMAD7蛋白表达量的影响。结果显示转染 miR-195抑制剂组相比于对照组有明显较高的SMAD7蛋 白表达水平(图4C)。此外,又进一步探究miR-195是否通 过靶向 SMAD7 促进人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分 化,首先通过脂质体转染构建 SMAD7 高表达的细胞 (pcDNA-SMAD7)和对照细胞(pcDNA-control), 然后诱导 其分化,在分化的第9天,检测碱性磷酸酶活性,发现 SMAD7高表达组的碱性磷酸酶活性明显低于对照组(图

Site-Directed Mutagenesis System 试

剂盒说明书突变 SMAD7 3’UTR上miR-195结合位点, 构建突变型 pGL3-MUT-SMAD7真核表达载体。 取人骨 髓间充质干细胞分别转染为以下 4 组:① SMAD7 野生 型质粒:对照组 ( 野生型 SMAD7 质粒和 miRNA 模拟物 对 照 ) , 实 验 组 ( 野 生 型 SMAD7 质 粒 和 miR-195 模 拟 物 ) ;② SMAD7 突变型质粒:对照组 ( 突变型 SMAD7 质粒与miRNA模拟物对照),实验组(突变型 SMAD7质 粒与 miR-195 模拟物 ) 。转染 24 h 后,收集细胞,用 Dual-Luciferase Reporter System 检测各组细胞的荧 光素酶活性。 1.5 主 要观察指标 miR-195 、 SMAD7 、 Runx2 、 osteopontin 和碱性磷酸酶活性在人骨髓间充质干细胞 成骨分化过程的表达;Runx2、osteopontin和碱性磷酸 酶活性在转染miR-195抑制剂与抑制剂对照的人骨髓间 充质干细胞诱导分化后的细胞中的表达;miR-195对人 骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的可能影响机制。 1.6 统计学分析 采用SPSS 18.0统计软件对数据进
_

行分析, 计量资料以x±s表示, 采用t 检验比较组间差异, P < 0.05为差异有显著性意义。

2
2.1

结果 Results
人骨髓间充质干细胞成骨分化能力 通过检测碱

4D)。 免疫印迹实验显示SMAD7高表达组相比于对照组有 明显较低的Runx2和osteopontin蛋白表达水平(图4E)。 以 上结果表明,miR-195通过靶向SMAD7促进人骨髓间充 质干细胞成骨分化。

性 磷 酸 酶 活 性 以 及 成 骨 分 化 特 异 基 因 Runx2 和 osteopontin 表达水平来观察人骨髓间充质干细胞成骨 分 化 能 力 , 发 现 碱 性 磷 酸 酶 活 性 以 及 Runx2 和 osteopontin的表达水平均随着诱导时间的增加而升高, 但在第9天和12天各项指标的水平没有明显差异(图1)。 这些结果表明分离培养的人骨髓间充质干细胞具有优 良的体外成骨分化能力。 2.2 表达 人骨髓间充质干细胞成骨分化miR-195和SMAD7 通过 qRT-PCR 和免疫印迹分别检测了 miR-195

3

讨论 Discussion
骨是一个连续动态平衡组织, 它主要包括 2 种细胞,

成骨细胞和破骨细胞,前者促进骨形成,后者促进骨吸 收。正常的骨组织中这 2 种细胞是平衡的,一旦打破这 种平衡,就会引发各类骨代谢性疾病
[21]

。中国是一个老

以及它的一个潜在靶 SMAD7在诱导过程中的表达水平 变化,发现miR-195随诱导时间的增加而升高,SMAD7 则相反,同样地,它们在第9天和12天的表达水平也无 明显差异(图2)。
6696

龄化日趋严重的国家,骨质疏松、骨裂、骨折等多种骨 代谢相关疾病已成为一个迫切需要解决的问题,必须尽 快找到一个行之有效的治疗措施来治疗这类疾病。提高 骨再生能力是治疗这类疾病的关键。
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图 1 人骨髓间充质干细胞成骨分化碱性磷酸
A 碱性磷酸酶的相对活性 100 80 60 40 20 0 0d 3d 6d 9d 12 d a b b b B Runx2 GAPDH osteopontin GAPDH

酶活性以及 Runx2 和 osteopontin 蛋白表达
0d 3d 6d 9d 12 d

Figure 1

The changes of alkaline

phosphatase activity and the expression levels of Runx2 and osteopontin protein during osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells 图注:图 A 为碱性磷酸酶活性检测结果;B 为 Runx2 和 osteopontin 蛋白表达。与 0 d 比较,
a

P < 0.01,bP < 0.001。

A miR-195 的相对表达水平 20 15 10 5 0 0d 3d 6d 9d 12 d a b b b

B

图 2 人骨髓间充质干细胞成骨分化 miR-195 和 SMAD7 表达
0d SMAD7 GAPDH 3d 6d 9d 12 d

Figure 2

The changes of expression levels of

miR-195 and SMAD7 during osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells 图注: 图 A 为 miR-195 表达结果; B 为 SMAD7 表达结果。与 0 d 比较,aP < 0.01,bP < 0.001。

A 碱性磷酸酶的相对表达水平 1.2 0.9 0.6 0.3 0 anti-miR-control miR-195 inhibitor A

B anti-miR-control Runx2 miR-195 inhibitor

图 3 miR-195 促进人骨髓间充质干细胞向成骨 细胞分化 Figure 3 miR-195 promotes osteogenic differentiation of human bone marrow

a

osteopontin

mesenchymal stem cells 图注:图 A 为碱性磷酸酶活性检测结果;B 为 Runx2 和 osteopontin 蛋白表达。与 anti-miRcontrl 比较,aP < 0.01。
B 1.5 荧光素酶活性 WI-3’UTR Mut-3’UTR a SMAD7 1.0 GAPDH C

GAPDH

anti-miR-control

miR-195 inhibitor

0.5

图 4 miR-195 通过靶向 SMAD7 促进人骨髓间充质干 细胞成骨分化 Figure 4 miR-195 promotes osteogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells by targeting SMAD7 图注:图 A 为互补碱基配对序列;B 为 SMAD7 荧光素 酶活性检测结果;C 为 SMAD7 蛋白表达;D 为碱性磷 酸酶活性检测结果; E 为 Runx2 和 osteopontin 蛋白表 达。与 pcDNA-contrl 比较,aP < 0.01。
D 碱性磷酸酶的相对活性

0 miR-control 1.2 miR-195 inhibitor E Runx2 0.8 osteopontin 0.4 a GAPDH 0 pcDNA-control pcDNA-SMAD7
[7,22-23]

pcDNA-control

pcDNA-SMAD7

人骨髓间充质干细胞是一类具有多向分化能力的成 体干细胞, 经不同条件诱导可以分化为成骨细胞、 成软骨 细胞、 脂肪细胞等多种细胞。 由于人骨髓间充质干细胞增 殖能力强、分化潜力大、免疫原性低、体外易培养等一系 列优点, 已成为骨组织工程理想的种子细胞, 在促进骨修
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复和重建方面具有重要的临床应用价值

。 提高人骨

髓间充质干细胞成骨分化能力是骨再生的关键。 miRNA 是 近 来 发 现 的 一 类 具 有 调 控 功 能 的 小 RNA,在多种生物学过程中发挥重要的调控作用
[8-9]



越来越多的 miRNAs 被报道能够调控人骨髓间充质干
6697

宋鹏,等. miR-195 对人骨髓间充质干细胞成骨分化的影响
[12]

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细胞成骨分化。 Wang 等

报道过表达 miR-346 通过靶
[13]

miR-195 抑制剂明显提高了 SMAD7 蛋白表达水平,进 一步证实了 miR-195 对 SMAD7 具有直接的作用。 进一 步实验探究 miR-195 促进人骨髓间充质干细胞向成骨 细胞分化是否通过靶向 SMAD7 起作用。利用脂质体转 染构建 SMAD7 过表达的人骨髓间充质干细胞,然后诱 导其分化,发现 SMAD7 抑制人骨髓间充质干细胞向成 骨细胞分化, 这与 miR-195 低表达对人骨髓间充质干细 胞成骨分化的影响一致。因此,得出结论,miR-195 通 过靶向 SMAD7 促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。 骨代谢相关疾病的发生是一个复杂的过程。通过对 人骨髓间充质干细胞成骨分化进行研究,以期在细胞层 面上获得 miR-195 在人骨髓间充质干细胞成骨分化中 的作用及其机制,为成骨发育以及骨代谢相关疾病的防 治提供新的线索和理论依据。

向 GSK3b 调控 Wnt 信号通路进而促进人骨髓间充质干 细胞向成骨细胞分化。Zhang 等 发现了 miR-20a 在 人骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化的过程中,表达量 逐渐升高。 通过研究 miR-20a 调控成骨分化的分子机制 发现,它通过靶向 PPAR γ , Bambi 和 Crim1 调控 BMP/Runx2 信号通路进而促进人骨髓间充质干细胞成骨 分化。Li 等
[14]

报道了 miR-29b 通过直接下调成骨分化的

抑制剂 HDAC4 、 TGFβ3 、 ACVR2A 、 CTNNBIP1 和 DUSP2 蛋白,从而促进成骨分化。一些 miRNA 也被报 道能够抑制间充质干细胞成骨分化, 例如, miR-145 通过 靶向 Sp7 抑制成骨分化,miR-433 通过靶向 Runx2 抑制 成骨分化
[15 , 24]

。miR-195 是一个近期受到广泛研究的

miRNA,关于它的研究主要集中在肿瘤领域。很多研究 报道了它的表达异常与多种肿瘤包括前列腺癌、 肾上腺皮 质癌、乳腺癌、胶质瘤、结肠癌、肝癌、黑素瘤、膀胱癌 等的发生、转移以及预后有关
[25-30]

作者贡献:宋鹏进行实验实施、数据统计,以及最终
成文、修改,宋鹏和荆凯进行实验设计、实施和评估,并 对文章审校,薛建华、魏鹏飞负责实验试剂提供。

。但是,关于 miR-195

在正常组织中的功能研究较少。最新一个研究报道 miR-195 在 小 鼠 骨 骼 肌 生 长 过 程 中 呈 上 调 表 达 , qRT-PCR 检测结果表明 miR-195 在出生后 2 d 的小鼠腿 肌中表达相对较低, 在出生后 2 周和 4 周的小鼠腿肌中的 表达明显升高, 在出生后 6 周的小鼠腿肌中表达最高, 上 调 10.70 倍,这暗示了 miR-195 参与了正常组织的生长 发育
[31-32]

利益冲突:所有作者共同认可文章内容不涉及相关利
益冲突。

伦理问题:抽取健康志愿者的骨髓,志愿者签署知情
同意书,经医院伦理委员会批准。

文章查重:文章出版前已经过 CNKI 反剽窃文献检测
系统进行 3 次查重。

。近期研究发现 miR-195 在人骨髓间充质干细
[16]

胞向成骨细胞分化的过程中, 表达量显著增加

。 推测可

文章外审:文章经国内小同行外审专家双盲外审,符
合本刊发稿宗旨。

能对人骨髓间充质干细胞成骨分化具有一定的促进作用, 而且通过靶基因预测软件发现抑制骨分化蛋白 SMAD7 是它的一个潜在靶,因此推测 miR-195 可能通过靶向抑 制 Smad7 蛋白表达促进人骨髓间充质干细胞成骨分化。 研究首先通过检测碱性磷酸酶活性以及成骨分化 特异基因 Runx2 和 osteoponti 在诱导成骨分化过程中 表达水平的变化,证实分离培养的人骨髓间充质干细胞 具有优良的体外成骨分化能力。作者也检测了 miR-195 和 SMAD7 在诱导成骨分化过程中的表达水平变化,发 现前者随诱导时间的增加而升高,后者则相反。接下来 脂质体转染构建低表达的 miR-195 人骨髓间充质干细 胞,诱导分化,通过检测碱性磷酸酶活性和骨分化标志 物 Runx2 和 osteopontin 的表达, 发现 miR-195 能够促 进人骨髓间充质干细胞成骨分化。随后通过荧光素酶实 验证实了 SMAD7 的确是 miR-195 的一个直接靶。 此外, 还检测了 miR-195 抑制剂与抑制剂对照转染的人骨髓 间充质干细胞中的 SMAD7 蛋白表达量,发现转染
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ISSN 2095-4344 CN 21-1581/R CODEN: ZLKHAH

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