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miR21抑制剂对肺腺癌细胞A549的抑制效果


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miR21抑制剂对肺腺癌细胞A-549的抑制效果
姜学东,王 【摘要】 琼,刘长浩,王国柱
目的探讨miR21抑制剂转染人肺腺癌细胞A一549对其体外侵袭及血管形成能力的影响。方法miR21抑制

剂转染A-549细胞,同时设置未转染的A一549细胞作为对照组,转染24、48、72及96 h后,四甲基偶唑氮法(MTT)法检测两组 细胞增殖抑制率;Transwell方法检测miR21抑制剂对A-549细胞侵袭的影响;小管形成实验检测miR21抑制剂对血管形成的 影响。结果转染24 h,两组抑制率比较,差别无统计学意义;转染48 h及以后,抑制剂组抑制率均高于对照组,差别有统计 学意义(P<0.05).Transwell检测结果显示miR21抑制剂组每个视野细胞数(1 1.60 4-5.32)个远少于对照组(107.60±3.21) 个,两组差别有统计学意义(P<0.01)。抑制剂组每视野小管计数平均(159.30 4-0.51)个,远少于对照组(508.80±1.30)个, 两组差别有统计学意义(P<O.01)。结论miR21抑制剂能够明显抑制A-549的侵袭能力.并能踢显抑制血管内皮细胞血管 生成,提示miR21抑制剂可以作为潜在的肺癌基因治疗的新方法。

【关键词】miR21抑制剂;细胞侵袭;血管形成;肺腺癌 【中国图书分类号】
R734.2

Inhibition of miR21 inhibitor
JIANG Xuedong,WANG

on

A-549 cells in vitro

Qinng,I.IU

Changhao,and WAN(;(,uuzhu.1)epartment of Thoracic Cardiovascular Sm’gery,l,iaoning

Provincial Corps Hospital,Chinese People’S Arnred Police Forces,Sheayang 1 1 0034,China

【Abstract】Objective

To study the inhibition of miR21 inhibitor¨n the invasion and

anti-an矛ogenesis

of A-549 cells.Methods

MiR21 inhihitor was transfected into A一549,and the control group was set up.24,48,72,96 hours after transfection,the effect of growth suppressing was quantified by 3-2(4,5-dimethyhhiazol一2一y1)2,5-diphe“ylletrazolium bromide(M717r)assay,anti—invasion Was ob— served hy transwell assay.Tube formation assay
was

use([to dete(。t the effects of miR21

inhibitor

on

human umbilical vein endothelial

cells(HUVEC)angiogenesis.Results

Twenty—four hours'after transfection,the suppressing rate was different between the two groups;
rates

48,72,96 h"after transfection,the suppressing tieally

in

inhibition group

were

higher than those in control group,the difference

was

statis—

significant(P<0.05).By

transwell assay,number of cells in inhibition group(1
was

1.60±5.32)was

less than that in control group

(107.60 4-3.21),the difference

statistically significant(P<0.01).Tubes
was

in

inhibition group(159.30±0.51)was less than that in miR21 inhibitor
call

control group(508.80 4-1.30),the difference
vasion

sta/istically significant(P<0.01).Conclusions
can

inhibit the in—

of A一549 and angiugenesis of HUVEC.miR21 inhihitor

he



potential gene—therapy

for gastric carcinoma.

【Key words】miRNA21
Micro

inhibitor;invasion;angiogenesis;hmg adenocarcinoma

RNA(miRNA)是一类内源性非编码小

时鉴于癌症是一种不能通过针对单个基因而被成功 治疗的异质性疾病。4j,因此未来对miRNA的控制能
力可能是治疗成功与否的关键。miR21是人类细胞 或组织中存在较为广泛并且发现较早的miRNA,在 人类miRNA的功能研究中发挥了不可替代的作用。 既往研究发现,miR21在肿瘤的发生发展中充当了 抗凋亡因子的角色b。。

分子RNA,是人类基因组的主要调控因子。目前这 些微小的细胞成分已进入到首选药物的行列
中H’2I。特别是在癌症中,某些miRNA本身就是非 常有“诚意”的癌基因和肿瘤抑制基因,完全符合成

为理想干预治疗点的严格标准。“癌基因依赖”一
词,过去专指蛋白质编码的癌基因,本意是指癌症细

胞生存特异性地依赖某个激酶,因此对其抑制剂异 常敏感,最近这个术语已延伸用于miRNA”j。miR- NA的治疗功能是基于其天然的催化过程,1个既定
的miRNA可以控制多种癌基因,并对癌症中的致癌 通路进行管制。正是由于miRNA具有这种能力,同
作者简介:姜学东,硕士,副主任医师,E—mail:jiangxd08@sina.tom 作者单位:110034沈阳,武警辽宁总队医院胸外科

本研究通过转染miR21抑制剂至肺腺癌细胞 A549,观察其对A549细胞体外侵袭及血管形成的 影响,为肺腺癌的治疗提供新的思路。
1材料与方法
1.1

材料与试剂

由中国医学科学院上海细胞生

物研究所提供人肺腺癌细胞A-549、人脐静脉内皮

万方数据

武鳘匡堂!!!!生!旦箜堑鲞筮§翅丛型』堡!也坠堕:Y!!:堑:盟!:§:丛型z垫!堡

501

细胞(HUVEC),美国GIBCO提供RPMll540培养 液,上海吉玛提供miR21抑制剂,美国Coming提供
Lipofectamine







2000(Invitrogen)、Transwell小室、96

2.1

MrlT法实验转染24 h,两组抑制率比较,差

孔板,美国BD提供Matrigel胶。
1.2

别无统计学意义;转染48 h及以后,抑制剂组抑制率 均高于对照组,差别有统计学意义(P<O.05,表I)。
表1

细胞培养和细胞转染无菌培养瓶中接种人肺

腺癌细胞A-549和HUVEC细胞,加入含10%胎牛血清 的适量PRMI一1640培养液,5%C02的37℃培养箱中常 规培养。用0.25%胰酶消化人肺腺癌细胞A549和 HUVEC细胞,取对数期生长细胞,计数细胞后用miR21 抑制剂终浓度100 nM转染A549细胞(抑制剂组),同 时设定未转染的A549细胞作为对照组。
1.3

mi陀1抑制剂组与对照组h549细胞生长抑制情况比较
(t/,=3;x±s;%)

MrITI'检测

取对数期生长期A549细胞于 2.2侵袭实验抑制剂组每个视野细胞计数平均 (11.60±5.32)个,对照组(107.60±3.21)个;与对 照组相比,抑制剂组穿过基质胶的细胞数量明显少 于对照组(图1),差异有统计学意义(P<0.01)。

37℃培养液,无CO:条件下培养。调整细胞浓度为5 ×104/ml,按每孔200出接种于96孔板,各组设4个 平行孔,每孔反应体系总体积为200山。在转染细胞
1、2、3、7、14

d时,每孔加入20山浓度为5

mg/ml

MrIT,继续培养4 h。吸去培养液后加人150一二甲 基亚砜(DSMO),在微量振荡器振荡10 min,室温孵 育30 min,检测光密度值(OD)。凋零组OD值为不 加细胞的空白凋零A490的OD值均数,各浓度组的 OD值为平行孔的平均OD值。对照组OD值为空白 对照组的平均OD值,miR21抑制剂抑制人肺腺癌细 胞A549增殖的作用采用细胞增殖抑制率CI表示,计 算公式如下:CI(%)=(对照组一实验组)OD/(对 照组一凋零组)OD×100%。相同条件下实验重复
3次。

1.4侵袭实验和小管形成试验用RPMI一1640培 养液稀释Matrigel,稀释比例为1:4。在Transwell上 室中加入0.04“的Matrigel稀释液,孵育1 h,使胶 凝固,保持37℃。每组人肺腺癌细胞A-549用无血 清培养液(含0.1%BSA)重新悬浮,调整细胞浓度为 2.0×105/ml。上室加入0.01 111l细胞,下室加人0.5 111l含血清培养液,CO:培养2 d后,取出小室,用棉签 擦掉上膜细胞,小室以甲醇固定和结晶紫染色各15 min,然后镜检,每个滤膜取5个视野(×100),计数取 平均值并分析。测取96孔板一20℃预冷后,每孔用 500一的Matrigel原液包被,摇动使之均匀分布于孔 的各个部位并避免产生气泡。保持温度37℃,孵育


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?jo麓;j‘≥三冬。≤;≥蠢暑≮≥。:|

h,使胶凝固。调整HUVEC细胞浓度至2.0×105/

IIll,每孔接种0.1 ml,继续培养2 d后用显微镜观察, 取5个视野(×100),取均值计数,照相分析。 1.5统计学处理用SPSSl3.0软件对数据进行 统计分析。计量资料用戈±s表示,组间均数比较采
用成组t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

謦妻≤蓼雾嚣毒誉:蓄

万方数据

502

武鳖医堂!Q!垒生!旦箜箜鲞箜!翅丛型』£!垫旦垒堕:y!!:堑:盟垒!:丛!Y,垫!璺

2.3

小管形成试验抑制剂组每视野小管计数平

方法发现了大量未知miRNAs,并将这些miRNAs归 类编号"J。miR21位于17q23.2染色体FRAl7B脆 性区域上,是具有自主转录单位的一种miRNA旧J。 研究表明,miRNA有致癌作用,在多种肿瘤细胞中 miR21的表达均显著异常,参与调控多种抑癌基因 的表达。研究发现,在神经胶质瘤细胞中,miR21的 表达升高,抑制miR21能促进细胞凋亡,致使凋亡 相关蛋白酶活性升高,使神经胶质瘤细胞生存能力 显著降低旧J。研究表明,miR21作为介入治疗的靶 标,抑制miR21可上调TMPl、PDCD4和maspin的 表达,减少乳腺癌MDA—MB-231细胞转移与侵入肺
部¨0|。抑制miR21可以作为晚期癌症防治的一种 新的治疗措施。

均(159.30±0.51)个,对照组(508.80±1.30)个, 抑制剂组与对照组比较,能明显抑制血管形成(P<
0.01,图2)。

本研究中,MTF实验显示,导人miR21抑制剂 能够明显抑制肺腺癌细胞A549;侵袭实验结果显 示,导入miR21抑制剂的肺腺癌细胞A549较未导

.‘-:。.?.o,’?’,:,I j一:?“,‘j},.、: ■≥’:010:o茹:.■,i,一:

入的A549细胞,增殖明显被抑制;同样,导人miR21 抑制剂的穿膜细胞数明显少于未导人miR21抑制 剂的A549细胞。小管形成实验结果显示,导人
miR21抑制剂的HUEC细胞形成血管的细胞数明显 少于未导入miR21抑制剂的HUVEC细胞。

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综上所述,miR21抑制剂转染肺腺癌细胞A549 后增殖可明显被抑制,同时miR21抑制剂转染的 HUVEC细胞能够明显抑制内皮细胞血管形成能力, 以及细胞的侵袭活性。由此表明,miR21可能通过 抑制肿瘤组织内血管的生成能力及肺癌细胞的侵袭
能力,从而抑制肺癌的发生发展过程,这将为肺腺癌

10¨:。■◆二.I_o?_一,;j ■、≯≯。0’,0≯.,;‘Z0,,≥’…t :,≯囊‘j;+r0■‘‘二:≮’j‘..‘Bj
.’:,.“.f。‘。‘.o~_t。?_一号
(结晶紫染色。×100)
^时皤蛔.R加制相|妇

.!。¨。.o,,。、?。-。i-”.’

‘.、_

基因治疗研究提供新的试验依据和理论基础。 【参考文献】
rl l

Vimalraj

S,Miranda P J,Ramyakrishna B,et a1.Reg-
cancer

3讨



ulation of breast

and bone metastasis by MicroR—

肺癌是我国最常见的恶性肿瘤,发病率逐年上 升,其中肺腺癌约占50%,对人们健康危害极大旧o。 药物基因组学和分子生物学的迅速发展,使得肺癌 的个体化治疗在临床实践中得到运用,基因治疗作 为一种特异高效的强治疗方法,越来越受到人们重 视。近年来,随着分子生物学和分子遗传学理论和 技术的发展,以及人们对肺癌发病机制的了解13益 深化,说明了很多基因可作为肺癌基因治疗的有效
靶基因。 近年来,miRNA在多种生物体中的存在不断

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得到证实。研究者用生物信息学、基因表达和克隆等

(下转506页)

万方数据

506

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无统一标准,因此对于眶一翼点入路术中颅底重建方 式的探讨还在不断进行中。随着医学技术、微创观 念的不断发展,以及材料科学的进步,相信效果好, 并发症少,操作方便,并带来较好美容效果的颅底重 建方法将得到更好的应用和发展。 【参考文献】
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of clear cell renal cell

toolecular

characterization

万方数据


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