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4-我国血站核酸检测现状及发展-王露楠


我国血站核酸检测 现状及发展
卫生部临床检验中心 王露楠

血站实验室测定技术的发展
对流免疫电泳试验 反向间接血凝试验 酶联免疫吸附试验(ELISA) 全自动化学发光免疫试验 免疫测定+病毒核酸检测

血液筛查方法的应用
检测的窗口期不断缩短
抗体(抗 原)检测 ? 抗-HIV ? HBsAg ? 抗-HCV 病毒抗原 检测 ? HIVp24 抗原 ? HCV 抗原 ? 抗原抗体联 合检测 病毒核酸 检测 ? NAT
? HIV-1 RNA ? HCV RNA ? HBV DNA

核酸检测方法直接检测病毒的RNA/DNA, 大大缩短了检测的窗口期

为什么要开展核酸检测
急性HIV症状 急性感 染期感 染 无症状 抗体 病毒血症

--------------------------------------------核酸
P24 抗体 ELISA a 0 2 3 b 4
从a到b的时间为窗口期



周 (感染时间)

血液筛查核酸检测的背景

血站实验室质量管理的发展
2007前
? 《血站管理办法》(暂行)(卫生部令第2号1998) ? 总体上的经验管理 ? 室内质量控制和室间质量评价 ? ISO9000认证

20072009

?《血站管理办法》(卫生部令第44号)(2005) ?《血站质量管理规范》》[卫医发(2006)167号] ?《血站实验室质量管理规范》[卫医发(2006)183号 ?血站每年的督导检查,ISO17025认可

? 《卫生部办公厅关于开展2010年血站核酸检测试点工作的通
2010知》(卫办医政函[2010]226号)--血站核酸检测试点

核酸检测试点单位数及检测量
? 2010年:15家试点单位,64.2万人份,占年献血人次 的6.3%。 ? 2011年:共21家血站(16个省市自治区)检测166.6 万人份占年献血人次的14.7%。 ? 2012年:有31家血站(19个省市自治区)共检测 256.8万人份,占年献血人次的20.6%。 ? 2013年:61家血站(25个省市自治区)共检测411.7 万人份,占年献血人次的32.0%。 3年7个月累计进行核酸检测899.3万人份。

我国核酸检测的进展情况
2010-2013年核酸检测进展
1400 1200 1000 800 600 400 200 0
64.2 1030 1133 1247 1288

411.6 166.6
256.8

2010年

2011年
核酸检测数量(万人份)

2012年
总检测数量(万人份)

2013年

亚太地区血液核酸检测

经血传播疾病的风险
? 一般人群HBsAg阳性率7.18%
我国现有的慢性HBV感染者约9300万人; 人口流动增加 乙型肝炎的各种治疗药物治疗方法导致HBV变异株 和隐匿性乙型肝炎感染者成为血液安全的威胁

? HCV感染者0.43% ? 估计存活HIV感染者78万 ? 少数高危人群献血比例较高

核酸检测工作实施方案
黑龙江

新疆 12.2%

吉林56.2%
辽宁 39.8%

北京87.8%
天津 99.5%

青海

宁夏
山东29.6%

西藏

西藏 四川 21.6%

陕西 49.5%

河南17.3%

上海 100% 湖北21.6%

湖南4.4% 贵州 5.8%

云南 32.6%
广西7.3%

海南100%

核酸检测不仅仅 是检测策略问题
我们需要的不仅仅是酶免疫检测

影响核酸检测推进的因素

?技术问题
实验室、设备、试剂、人员
《血站核酸检测实验室管理办法》 《全国血站核酸检测技术指导意见》 技术培训

影响核酸检测推进的因素

?资金问题
一次性投入:实验室改造、设备购置 2010年《2010年血站核酸检测项目 管理方案》,投入1.65亿 持续的投入:按照平均检测成本(60元/人份), 全年献血1260万人次计算,全国需投入7.6亿元。

影响核酸检测推进的因素

?集中化检测问题
2006年即提出集中化检测模式 分级财政的问题使得集中化检测难以实现 解决措施 ?分级财政?中央财政统一拨款 ?统一检测,检测费用由财政统一支出 ?调整血价

提得最多的其他问题
? 检测费用 ? 集中检测的协调

“试点”的含义
? ? ? ? ? 一个需要改变原来工作流程不同的新的领域 一个发现问题解决问题的过程 一个取得经验的过程 一个求证的过程 一个获得最佳流程的过程

血站核酸扩增检测国内目前所用的试 剂及方法特点
上海科华 上海浩源 中山达安 ROCHE (Cobas TaqScreen MPX Test) 多重实时荧 光PCR 有 一管内多重 PCR,不能 区分是何指 标
HAMILTON Microlab? STAR IVD Pipettor混样 仪、COBAS AmpliPrep Instrument全自动核酸 提取仪、COBAS TaqMan Analyzer和the Pooling and Data Management (PDM) Software

Chiron (Procleix@ Ultrio TM Assay) TMA 有 一管内联合 检测先不区 分,反应性 样本再行单 个指标检测
TECAN混样仪 (如混合样本)、 TMA检测仪(一 管内完成提取、 扩增及杂交发光 检测)

方法 内标

实时荧光 PCR 有

实时荧光 PCR 有 一管内多重 PCR,但直 接检测三项 指标。 HAMILTON 混样仪、提 取仪、实时 荧光PCR仪

实时荧光 PCR 有 各指标分管 检测

HBV、HCV、 各指标分管 HIV检测模式 检测

检测系统的 组成

HAMILTON 混样仪、提 取仪、实时 荧光PCR仪

混样仪、提 取仪、实时 荧光PCR仪

我国血站NAT试点给我们带来了什么?
? 证明了我国血站NAT的必要性 ? 初步形成了我国血站NAT及其质量保证(标本 采集等、室内质控和室间质评)的模式和方法 ? 探索了我国血站NAT人员培训的模式和方法 ? 血站对NAT逐步增强了自信 ? 实验室人员的质量意识进一步得到了加强

展望
? 新的《血站技术操作规程》(卫医政发〔2012〕1号附 件):一遍ELISA,一遍NAT。 ? 《全面推进血站核酸检测工作实施方案(2013-2015 年)》(卫计生发[2013]22号):到2015年,血液筛 查核酸检测基本覆盖全国。 2013年,东部60%(省会70%)、北京上海80%、中部 50%、西部30%(省会40%)以上。以后基本是每年增加 10%。

工作任务之一,是加强质量管理和控制。 整体提高血站实验室管理水平。

2010年6月-2013年12月血液筛查
核酸检测数量 仅占同期检测 量的19.1%

超过80%的血液存 在传播 HIV/HCV/HBV的 风险!

实验室检测策略

? 采血前初筛 ? ELISA检测 ? 核酸检测 ? 样本的进一步验证、确认及献血 者随访

HBV DNA -HBsAg
? 酶免检测的结果评估 ? 酶免检测的不可替代性 ? 核酸检测是否存在假阳性或假阴性 联检阳性率 鉴别阳性率 与血清学指标的相关性

HBV DNA阳性-多数源于隐匿性感染
? 肝脏有HBV DNA复制且血清中未检测到 HBsAg ? 有别于窗口期 ? 一般都为HBcAb阳性(50%HBsAb也为阳 性) ? 很少一部分为单独HBsAb阳性 ? 没有抗体的初期隐匿性感染

HBV DNA试剂的状况

Ultrio

鉴别

MPX, v2.0

MPX (v1) PI 浩源

科华

HBV

10.44IU/ml

8.52IU/ml

2.4IU/ml

3.8IU/ml

6.3IU/ml

5IU/ml

HBV DNA-HBsAg
?HBV NAT 无疑为血液安全提供了更好地保障 ?血清学检测 和NAT 互补,不可互相替代 ?依然有可能漏检 ?导致OBI产生是多原因的,情况各不同 ?造成输血后感染的危险 窗口期> anti-HBc OBI> anti-HBs OBI ?疫苗的作用与基因型有关? ? ? 慎重调整抗原抗体的检测试剂 HBsAg漏检,特别是低值或变异株漏检,往往是sAg-eAb-cAb或 sAb-cAb血清学模式,这类模式往往HBV DNA含量很低,甚至< 5IU/ml,目前核酸检测水不可能达到100%检出。

核酸检测试剂问题
阳性预期值
110 105 100 95 阳性预期值 阴性预期值 90 85 80 75 70 65 60 36 38 40 42 ct值 44 46 48 50 江西 全国 青岛 92 82 72 62 52 42 32 22 12 2 36 38 40 42 44 46 48 50 ct值 江西 全国 青岛

阴性预期值

抗HCV与HCV RNA
? 抗HCV酶免单试剂阳性的结果 641,482
样本总 复检所用 数 试剂结果 为阴性 1028 204 1.60‰ 0.32‰ 复检出现1 家或以上试 阴性 剂阳性 824 138 1.28‰ 0.22‰ 确认结果 不确定 阳性 635 51 0.99‰ 0.08‰

抗HCV阳性 HCV RNA阴性
HCV RNA阳性和阴性的样本的化学发光检测结果S/Co 分布
400 350 300 250 200 150 100 50 0 RNA阳性总数 RNA阴性总数

1.01-5.00

5.01-8.0

8.01-20

>20

试剂的状况
MPX (v1) 浩源 科华 Ultrio 鉴别 MPX, v2.0 PI 3.01/ml 3.17IU/ml 7.1IU/ml 11.0IU/ml 23.3IU/ml 50IU/ml

HCV

抗HCV与HCV RNA
? 抗HCV漏检:当抗HCV为阳性时,HCV RNA 不一定为阳性,而低值抗HCV虽然HCV RNA 阳性比例低,但往往这部分样本的HCV RNA含 量并不高。 ? 核酸检测灵明度高,但仍有可能漏检。

关于HIV
? MSM献血员是各国都面对的问题 几乎100%

试剂的状况
Ultrio HIV HIV-1 M HIV-1 O*** HIV-2*** 29cps MPX (v1) 浩源 科华 MPX, v2.0 PI 47.6IU/ml 50IU/ml 48.3IU/ml 21.3IU/ml 49IU/ml 89IU/ml

鉴别 33cps

65.1IU/ml 59.3IU/ml

核酸检测试剂问题
检测系统 检测模式 检测下限 HBV DNA 罗氏 混样后检测(即 混合后每毫升) 混样后检测 混样后检测 Ultrio 鉴别 3.7 IU/ml 6.3IU/ml 5IU/ml 10.44 IU/mL 8.52 IU/mL HCV RNA 10.7 IU/ml 23.3 IU/ml 50 IU/ml 3.01IU/ml 3.17IU/ml HIV RNA 49copies/ml (HIV-1 M) 1IU=0.49copies 47.6 IU/ml 50 IU/ml 29copies/ml 1IU=0.65copies 33copies/ml 1IU=0.65copies

浩源 科华 诺华

核酸检测试剂问题
HBV DNA Concentration (IU/mL) 12.0 5.0 4.0 3.6 1.3 0.4 Number of Reactives Number of % Reactives Individual Tests 95% Lower Confidence Limit (one-sided) 98.4% 96.1% 93.2% 90.9% 58.5% 19.5%

189 194 182 186 129 47

189 197 189 197 200 191

100.0% 98.5% 96.3% 94.4% 64.5% 24.6%

核酸检测试剂问题
? 检测灵敏度—概率问题 ? 含量低到一定程度重复性差,不同试剂检测 结果差异大,不能以一次检测评价试剂


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