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miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响及机制


中国组织工程研究 第 20 卷 第 11 期

2016–03–11 出版
www.CRTER.org

Chinese Journal of Tissue Engineering Research March 11, 2016 Vol.20, No.11

·研究原著·

miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响及机制
李连冲(南阳医学高等专科学校第一附属医院心血管外科,河南省南阳市 473000) 引用本文:李连冲. miR-25 对 P19 细胞向心肌细胞分化的影响及机制[J].中国组织工程研究,2016,20(11):1584-1590. DOI: 10.3969/j.issn.2095-4344.2016.11.010 ORCID: 0000-0002-7557-8873(李连冲) 文章快速阅读:
miR-25 对 P19 细胞向心肌细胞分化的影响
细 沉 默 Pax3 , 观 察 Pax3 对 P19 细胞向心 肌细胞分化的影响 体外培养 P19 细胞并 向心肌细胞的诱导分 化 探索 miR-25 对 P19 细胞向心肌细胞分化 的影响及其机制 荧光素酶实验检测 miR-25 对 Pax3 的靶 向作用

李连冲, 男, 1979 年生, 汉族, 郑州大学医学院毕 业, 主治医师, 主要从事 心脏血管外科方面的研 究。
中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:2095-4344 (2016)11-01584-07 稿件接受:2016-01-27 http://WWW.crter.org

RT-PCR 检测 miR-25 在 向心肌分化的和未分化 的 P19 细胞中的表达水 平 脂质体转染构建 miR-25 过表 达的 P19 细胞,观察 miR-25 对 P19 细胞向心肌细胞分化 的影响。

miRNA 靶 基 因 预 测 数 据 库 预 测 miR-25 的靶基因

文题释义: 微小 RNA:肿是内源性的非编码单链小 RNA,它通过与靶基因 mRNA 3’UTR 区域结合,引起 mRNA 降解或阻止其翻译从而调控基因表达。一个 miRNA 可以调控众多基因的表达,几个 miRNA 也可以组 合来精细调控某个基因的表达。 据报道目前总共有 16,772 个 miRNA, miRNAs 几乎参与了每一个生物 学过程。 心肌细胞:又称心肌纤维,有横纹,受植物性神经支配,属于有横纹的不随意肌,具有兴奋收缩的能 力。呈短圆柱形,有分支,其细胞核位于细胞中央,一般只有一个。各心肌纤维分支的末端可相互连 接构成肌纤维网。广义的心肌细胞包括组成窦房结、房内束、房室交界部、房室束(即希斯束)和浦肯野 纤维等的特殊分化了的心肌细胞,以及一般的心房肌和心室肌工作细胞。

摘要
背景:既往研究发现,miR-25 在向心肌分化的 P19 细胞中的表达水平显著低于其在未分化的 P19 细 胞中的表达水平,但是其对心脏发育的影响及其机制尚不明确。 目的:探索 miR-25 对 P19 细胞向心肌细胞分化的影响及其机制。 方法:体外培养 P19 细胞并向心肌细胞诱导分化。通过实时反转录 PCR 检测 miR-25 在向心肌分化的 和未分化的 P19 细胞中的表达水平。通过脂质体转染构建 miR-25 过表达的 P19 细胞,观察 miR-25 对 P19 细胞向心肌细胞分化的影响。通过 miRNA 靶基因预测数据库预测 miR-25 的靶基因,并利用荧 光素酶报告基因实验检测 miR-25 对 Pax3 的靶向作用,沉默 Pax3,观察 Pax3 对 P19 细胞向心肌细 胞分化的影响。 结果与结论:miR-25 在分化的 P19 细胞中表达水平较低。miR-25 过表达能够促进 P19 细胞向心肌细 胞分化。靶基因预测分析 Pax3 为 miR-25 潜在的靶基因,荧光素酶实验进一步证实 Pax3 是 miR-25 的直接靶点,Pax3 沉默促进 P19 细胞向心肌细胞分化。提示 miR-25 通过靶向 Pax3 促进 P19 细胞向 心肌细胞分化,为心脏发育以及先天性心脏病的防治提供新的线索和理论依据。 关键词:

组织构建;组织工程;心肌细胞;miR-25;P19 细胞;分化;先天性心脏病;Pax3

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李连冲. miR-25 对 P19 细胞向心肌细胞分化的影响及机制
Li Lian-chong, Attending physician, Department of Cardiovascular Surgery, the First Affiliated Hospital of Nanyang Medical College, Nanyang 473000, Henan Province, China

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主题词:

肌细胞,心脏;微小 RNA;细胞分化

Effect of miR-25 on the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes and its mechanism
Li Lian-chong (Department of Cardiovascular Surgery, the First Affiliated Hospital of Nanyang Medical College, Nanyang 473000, Henan Province, China)

Abstract
BACKGROUND: Previous studies have found that the expression level of miR-25 in differentiated P19 cells is significantly lower than that in undifferentiated P19 cells. However, the effect of miR-25 on cardiomyogenesis and the relevant mechanism remain unclear. OBJECTIVE: To explore the effect and mechanism of miR-25 on the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. METHODS: P19 cells were cultured and differentiated into cardiomyocytes in vitro. The expression of miR-25 in differentiated and undifferentiated P19 cells was detected by real-time PCR. miR-25-overexpressing P19 cells were constructed by lipofection transfection, and were used to investigate the effect of miR-25 on the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. MicroRNA target analysis tools were used to explore potential targets of miR-25, and dual luciferase reporter assay was used to identify whether the 3’UTR of Pax3 mRNA was a binding target of miR -25. In addition, we transfected P19 cells with Pax3 shRNAs to silence the expression of Pax3, and investigated the effect of Pax3 on the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. RESULTS AND CONCLUSION: Expression level of miR-25 in differentiated P19 cells was obviously down-regulated compared with that in undifferentiated P19 cells. miR-25 overexpression promoted the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. By target prediction analysis, we confirmed that Pax3 was a potential target gene of miR-25. Luciferase assay further confirmed that miR-25 targeted Pax3 directly. Moreover, knockdown of Pax3 promoted the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes. Taken together, miR-25 promotes the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes by targeting Pax3. These findings offer new clues and theoretical basis for cardiomyogenesis and prevention and cure of congenital heart disease. Subject headings: Myocytes, Cardiac; MicroRNAs; Cell Differentiation Cite this article: Li LC. Effect of miR-25 on the differentiation of P19 cells into cardiomyocytes and its mechanism. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu. 2016;20(11):1584-1590.

0 引言 Introduction
先天性心脏病是最常见的先天畸形之一,在中国的 发病率为0.7%-0.8%,中国每年新增加的先天性心脏病 患儿大约15万 。据报道先天性心脏病发病的主要原因 是胚胎干细胞向心肌细胞分化的过程受损,而基因因素 对该受损过程的发生起了重要作用
[2-3] [1]

码的小RNA分子, 它通过与靶基因mRNA 3’UTR区域结 合,引起mRNA降解或阻止其翻译从而调控基因表达。 生物信息学分析表明每个miRNA调控成百上千基因, 而 且 miRbase 数据库 (www.mirbase.org) 公布的数据显示 目 前 共 发 现 16 772 个 miRNAs , 这 也 从 侧 面 表 明 了 miRNAs几乎参与了每一个生物学过程
[5-6]

。 心脏是脊椎动物

。已有研究证 。 很多研究也

胚胎发育最早形成并发挥功能的重要器官,其形成是一 个极其复杂而精密的过程,包括遗传调控程序在空间和 时间上相互协调,许多相关基因的顺序表达以及多条信 号通路(如Wnt信号通路、FGF信号通路、骨形态发生蛋 白信号通路、Notch信号通路等)的激活和精确调控,其 中任意基因的缺失或突变都可能会导致心脏发育畸形 。 因此,从基因和分子水平上来探索心脏的形成和发育机 制为先天性心脏病的预防和治疗提供了新的方向。 微小RNA(miRNA)是由19-23个核苷酸组成的非编
[4]

实miRNAs参与并调控时序发育、细胞增殖、分化、凋 亡、 衰老以及激素分泌等多种生理过程 发挥着重要的作用
[9-20] [7-8]

报道了miRNAs在人类各种疾病的发生、发展和预后中 。目前,它们在心肌细胞分化以 及心脏发育过程中的重要作用受到了广泛关注。越来越 多的研究证实 miRNAs 对心脏发育起着重要的调控作 用
[21-25]

。但是miRNAs致胚胎心脏发育畸形的精确机制

尚未阐明,因此继续发掘新的与心脏发育相关的 miRNAs,寻找其下游的靶分子,并探究其对心脏发育

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的分子调控机制依旧非常重要。 P19细胞从C3H/He雄性小鼠的畸胎瘤中分离获得, 是一种能够在体外培养的多能干细胞,具有自我复制和 分化的潜能。 在低浓度的二甲亚砜诱导下, P19细胞可分 化为心肌样细胞,这一过程被用于模拟心脏发育,目前 已经作为心肌细胞模型广泛应用于心脏发育的分子机制 研究中
[26]

培养基为α-MEM完全培养基, 其中包含体积分数10%胎 牛血清、100 mg/L链霉素和100 U/mL青霉素,将P19 细胞置于该培养液中于37 ℃、体积分数5%CO2孵箱中 培养, 每隔2 d换一次培养液, 待细胞汇合度达到约90% 时,用0.25%胰蛋白酶进行消化,并依据细胞的生长情 况按一定比例传代培养。基础培养基中添加1% 二甲亚 砜即为诱导培养基。 将消化后的单个P19细胞进行计数, 按3.7×10 细胞密度接种于直径为60 mm 含有诱导培养 基的细胞培养皿内,于37 ℃、体积分数5%CO2孵箱中 培养,每隔2 d换1次培养液。诱导当天记为第0天。诱导 6 d后去除二甲亚砜,继续培养,每隔2 d换1次培养液 。 1.4.2 细胞转染
5 [33] 5

。因此在本研究选择P19细胞作为研究对象。

miR-25 是近期受到广泛研究的 miRNA ,其在多种 疾病中发挥重大的作用,尤其是在癌症中。已有研究报 道miR-25促进胆管癌、卵巢癌、胃癌、食管鳞癌、宫颈 癌、胶质瘤等恶性肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移
[27-31]



此外,也有研究报道miR-25在已分化的P19细胞的表达 水平明显低于其在未分化的P19细胞中的表达水平,但 是其对心脏发育的影响及其机制尚未有报道
[32]

选取对数期生长状态良好的 P19 细

胞,以3×10 /孔的密度接种到 6孔培养板中,孔中均加 有不含抗生素的培养液,置于37 ℃、体积分数5%CO2 孵箱中培养。待细 胞融合 度达到约 50% , 严格按照 Lipofectamine 2000 转染试剂盒说明书进行转染,将 miR-25 模 拟 物 对 照 (miR-control) 、 miR-25 模 拟 物 (miR-25 mimics) 、 Pax3 shRNA(shPax3) 和 对 照 (sh-control)转染至P19细胞内,转染24 h后更换新鲜的 培养液。 1.4.3 实时反转录PCR(RT-PCR) 取检测的细胞,分 别加入 RNAiso Plus 或 RNAiso for small RNA 提取总 RNA或总miRNA,用琼脂糖凝胶电泳测其质量,紫外分 光光度计测其浓度和纯度,用无RNA酶水稀释为1 g/L。 然 后 依 照 One Step PrimeScript
? ?

。 实验首

先检测 miR-25 在未分化的和诱导分化第 10 天的 P19 细 胞中的表达水平,接下来脂质体转染构建过表达的 miR-25 P19细胞,诱导分化,通过检测心肌分化相关标 志物cTnT、GATA4和ANP的表达,鉴定其对P19细胞分 化的作用,随后通过靶基因预测,荧光素酶实验等初步 探讨其可能的作用机制。

1 材料和方法 Materials and methods
1.1 1.2 1.3 设计 细胞分子生物学体外实验。 实验于2014 年 1月至12月在郑州颐 时间及地点 材料

和医院病理科完成。 P19细胞购自美国菌种保藏中心。

miRNA cDNA

Synthesis Kit说明书进行反转录得到cDNA,将其稀释4 倍, 然后加入SYBR Premix Ex Taq Ⅱ, miR-25以U6 作为内参基因,Pax3 mRNA以GAPDH作为内参基因, 在 Chromo4 实时定量 PCR 仪上进行定量,结果采用 Opticon-3软件进行分析 1.4.4 免疫印迹
[34] TM TM

实验试剂及仪器 : α-MEM 培养基胎牛血清 ( 美国
Gibco公司);二甲亚砜 (美国Sigma公司);0.25%胰蛋 白酶(德国Miltenyi Biotec公司); U6和GAPDH(上海诺伦 生物医药技术有限公司);Lipofectamine 2000转染试剂 盒, One Step PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit 和 GeneTailorTMSite-Directed Mutagenesis System 试剂盒 ( 美国 GeneCopoeia 公司 ) ; cTnT 抗体、 GATA4 抗体、ANP抗体、GAPDH抗体和辣根过氧化物酶标记 二抗 ( 英国 Abcam 公司 ) ; miRNA 模拟物对照, miR-25 模拟物, Pax3 shRNA和shRNA对照(西安沃尔森生物技 术有限公司); SYBR Premix Ex Taq Ⅱ, RNAiso Plus 和RNAiso for small RNA(宝生物工程(大连)有限公司); Chromo4 实时定量PCR 仪(上海智中实验室设备有限 公司);硝酸纤维素膜(北京索莱宝科技有限公司)。 1.4 1.4.1
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TM ? TM ?



通过脂质体转染构建 miR-25过表达

的细胞和对照细胞, 然后诱导其分化, 在分化的第10天, 采用免疫印迹检测两组细胞中心肌分化 相关标志物 cTnT、GATA4和ANP蛋白的表达。 提取细胞样本的总蛋白,定量,取等量的蛋白用 10%的分离胶进行电泳。 电泳结束之后, 在冰浴下100 V 转至硝酸纤维素膜上,转膜2 h。然后使用5%脱脂牛奶 室温封闭 1 h ,加入相对应的一抗4 ℃孵育过夜,使用 TBST洗涤3次,每次15 min。接着加入二抗,37 ℃孵育 1 h,使用TBST洗涤3次,每次20 min,于暗室中进行 压片,然后显影、定影。 1.4.5 miR-25靶基因预测 采用TargetScan、DIANA
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实验方法 P19 细胞培养及向心肌细胞的诱导分化 基础

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miR-25 的相对表达水平

1.5 cTnT 1.0 a GATA4 ANP GAPDH 0 0d 10 d miR 对照 miR-25

0.5

图 1 miR-25 在 P19 细胞诱导分化 0 d 和第 10 天中的表达水平 Figure 1 Expression level of miR-25 in differentiated (day 10) and undifferentiated (day 0) P19 cells 图注:miR-25 在 P19 细胞分化第 10 天的表达水平显著低于其在 0 d 中的表达水平,与 0 d 比较,aP < 0.01。

图 2 miR-25 对 P19 细胞心肌分化相关标志物 cTnT、GATA4 和 ANP 蛋白表达的影响 Figure 2 The effect of miR-25 on the expression level of cTnT, GATA4 and ANP in P19 cells 图注:miR-25 过表达的 P19 细胞相比于对照组有明显较高的 cTnT、GATA4 和 ANP 蛋白表达水平。
B 荧光素酶相对活性 1.5
Wt-3’UTR Mut-3’UTR
a

A

1.0

0.5

Pax3 mRNA 相对表达水平

C

1.5 0 1.0 a D miR 对照 miR-25

0.5

Pax3 GAPDH

0 miR 对照 miR-25 miR 对照 miR-25

图3

荧光素酶实验检测 miR-25 对 Pax3 的靶向作用 miR-25 directly targeted Pax3 detected by luciferase assay

Figure 3

图注:图 A 为 Pax3 mRNA 的 3’UTR 与 mRNA 的种子区存在理论上的互补配对序列;B 为荧光素酶相对活性;C 为 Pax3 mRNA 表达; D 为 Pax3 蛋白表达。表明在 P19 细胞中,miR-25 能够直接靶向 Pax3。与 miR 对照比较,aP < 0.01。

cTnT

图 4 Pax3 沉默对 P19 细胞心肌分化相关标志物 cTnT、GATA4 和 ANP 蛋白表达的影响
GATA4 ANP GAPDH Sh 对照 sh-Pax3

Figure 4

The effect of knockdown of Pax3 on the expression level of cTnT, GATA4 and

ANP in P19 cells 图注:与对照组相比,Pax3 沉默组有明显较高的 cTnT、GATA4 和 ANP 蛋白表达。

和miRanda 3 个miRNA 靶基因预测数据库对 miR-25 的 靶基因进行预测。 1.4.6 荧光素酶实验 将预测结果进行比对之后, 选取 被 3 个数据库都预测到的靶基因作为备选,进而选得 Pax3为靶基因。将Pax3 3’UTR的PCR扩增产物连接到 pGL3质粒Xbal I酶切位点,构建野生型pGL3-WT-Pax3 报 告 基 因 质 粒 。 采 用 GeneTailor
TM

达载体。取 P19 细胞分别转染为以下 4 组:① Pax3 野 生型质粒:对照组 (转染野生型 Pax3 质粒和 miRNA 模 拟物对照 )、实验组 (转染野生型 Pax3质粒和 miR-25模 拟 物 ) 。 ② Pax3 突 变 型 质 粒 : 对 照 组 ( 转 染 突 变 型 Pax3 质 粒 与 miRNA 模 拟 物对 照 ) 、 实 验 组 (转 染 突 变 型 Pax3 质 粒与 miR-25 模 拟物 ) 。 细胞 转 染 24 h 后 , 按 照 Dual-Luciferase Reporter System 说明检测的荧 光素酶活性。 1.5 主要观察指标 ① miR-25对P19细胞向心肌细胞
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Site-Directed

Mutagenesis System 试剂盒,突变 Pax3 3’UTR 序列 内的结合位点,构建突变型 pGL3-MUT- Pax3真核表
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分化的影响。②荧光素酶实验检测miR-25对Pax3的靶 向作用。③Pax3 沉默对 P19 细胞心肌分化相关标志物 cTnT、GATA4和ANP蛋白表达的影响。 1.6 统计学分析
_

疾病,在活产婴儿中发生率约为 8‰,是婴幼儿死亡最 主要的原因之一
[35]

。多年来,先天性心脏病已经引起了

科学家的高度重视,并一直致力于研究其发生的潜在病 因。 但是每年围产期死亡中仍有约 40%是由先天性心脏 病导致的, 其中有 1/5 死于出生后的第 1 个月 有效的预防和治疗措施成为了新的突破点。
[36]

应用GraphPad Prism 5统计软件处

理数据,结果以x±s表示,组间比较采用 t 检验,以P < 0.05为差异有显著性意义。

。 因此,

从基因和分子水平上探究先天性心脏病的病因以寻找 近几年来,miRNAs 凭借其性质稳定、含量丰富、 易于发现以及疾病特异性等特点,成为了分子生物学研 究的热点
[37- 38]

2 结果 Results
2.1 miR-25在分化的P19细胞中低表达 通过RT-PCR 检测miR-25在P19细胞诱导分化0 d和第10天中的表达 水平, 结果显示miR-25在P19细胞分化第10天的表达水 平显著低于其在0 d中的表达水平(P < 0.01;图1),和 Hu等 2.2
[32]

。 目前越来越多的研究证实 miRNAs 对心
[22]

脏发育起着重要的调控作用。Wagh 等

报道了,在人

胚胎干细胞向心肌前体细胞分化过程中, miRNA-363 通过调节心脏和神经嵴衍生基因 HANDl 的表达从而影 响心肌细胞的特化。 Li 等
[21]

报道的结果相一致。 结

miR-25过表达促进 P19细胞向心肌细胞分化

发现降低 miR-1 的表达能够

果显示 miR-25 过表达的 P19 细胞相比于对照组有明显 较高的cTnT 、GATA4和ANP蛋白表达水平,这表明了 miR-25能够促进P19细胞向心肌细胞的分化进程(图2)。 2.3 荧光素酶实验检测 miR-25 对 Pax3 的靶向作用 Pax3 mRNA的3’UTR与miR-25的种子区存在理论上的 互补配对序列,见图 3A。发现共转染 Pax3野生型的实 验组的荧光素酶活性明显低于对照组的荧光素酶活性 (P < 0.01),而共转染Pax3突变型的实验组与对照组的 荧光素酶活性无显著差异, 这证实miR-25可以直接作用 于Pax3(图3B)。 进一步实验,研究转染miR-25 模拟物和miRNA 模 拟物对照对P19 细胞中Pax3 mRNA 和蛋白表达量的影 响 。 结 果 显 示 转 染 miR-25 模 拟 物 明 显 降 低 了 Pax3 mRNA和蛋白的表达水平(P < 0.01; 图3C和D)。 以上结 果均表明在P19细胞中,miR-25能够直接靶向Pax3。 2.4 Pax3沉默促进 P19细胞向心肌细胞分化 通过脂 质体转染沉默Pax3的表达,然后诱导其分化, 在分化的 第10天,采用免疫印迹检测心肌分化相关标志物cTnT、 GATA4和ANP 蛋白的表达。结果显示 Pax3沉默组与对 照组相比有明显较高的 cTnT 、GATA4和ANP 蛋白表达 水平,这表明了Pax3沉默促进P19细胞向心肌细胞分化 (图 4)。Pax3沉默与miR-25过表达对P19细胞分化的影 响一致。 以 上 结 果 表 明 Pax3 是 miR-25 的 一 个 直 接 靶 , miR-25对P19细胞向心肌细胞分化的影响依赖于Pax3。

缓解对细胞骨架调节蛋白 twinfilin-1 的抑制作用,促进 心肌肥厚的发生,而将 miR-1-2 敲除,小鼠易发生大面 积室间隔缺损,导致出生后很快死亡。Ventura 等
[23]



现 miR-17-02 基因簇功能缺失可导致新生小鼠体积较 小而且很快死亡, 这可能是因为缺乏 miR-17-02 基因簇 的小鼠存在室间隔缺损及肺发育不全。Chen 等 能正常的环化形成心腔。Morton 等
[25] [24]

报道

了 miR133 过表达导致爪蟾的胚胎心脏在发育过程中不 发现 miR-138 的 敲除导致了斑马鱼的心肌细胞发育异常以及心室功能 障碍。 虽然越来越多的 miRNAs 被发现与心脏发育畸形 相关,但是具体的致畸机制并不完全清楚。 miR-25 是近期受到广泛研究的 miRNA,其在多种 疾病中发挥重大的作用。近期有研究报道 miR-25 在已 分化的 P19 细胞的表达水平显著低于其在未分化的 P19 细胞中的表达水平
[32]

。 推测可能对胚胎心脏发育具

有一定的作用,但是其对心脏发育的影响及其机制尚未 有报道。 因此此次研究首先检测 miR-25 在诱导分化 0 d 和第 10 天的 P19 细胞中的表达水平,证实 miR-25 在 诱导分化第 10 天 P19 细胞的表达水平确实明显低于其 在分化 0 d 的表达水平,接下来脂质体转染构建过表达 的 miR-25 P19 细胞,诱导分化,通过检测心肌分化相 关标志物 cTnT、GATA4 和 ANP 的表达,发现 miR-25 能够促进 P19 细胞向心肌细胞分化, 随后又进一步探索 其可能的作用机制。 通过 3 个靶基因预测数据库预测得到 Pax3 为 miR-25 潜在的靶基因, Pax3 mRNA 的 3’UTR 与 miR-25 的种子区存在理论上的互补配对序列。Pax 基因是一个 进化上高度保守的基因家族,普遍存在于各种生物体
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3 讨论 Discussion
先天性心脏病是一种心脏及其大血管先天畸形的
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中,其表达的蛋白是重要的转录调控因子。研究报道 Pax3 是胚胎发育时期的重要转录调控因子,调控人胚 胎早期胃组织、小肠肌层、小肠黏膜、脊髓等的生长发 育
[39-41]

[3]

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。Li 等

[42]

[4]

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报道了诱导 Pax3 表达能够阻碍心肌分
[5] [6]

化。以上发现是作者选取 Pax3 进行继续研究的原因。 此次研究通过荧光素酶实验证实了 Pax3 的确是 miR-25 的一个直接靶基因。此外,还检测了 miR-25 模 拟物与 miRNA 模拟物对照转染的 P19 细胞中的 Pax3 的表达量,发现转染 miR-25 模拟物明显降低了 Pax3 mRNA 和蛋白的表达水平,进一步证实了 miR-25 对 Pax3 具有直接的作用。又进一步执行实验探究 miR-25 促进 P19 细胞向心肌细胞分化是否通过靶向 Pax3 起作 用。利用脂质体转染沉默 Pax3 的表达,然后诱导其分 化,发现 Pax3 沉默促进 P19 细胞向心肌细胞分化,这 与 miR-25 过表达对 P19 细胞分化的影响一致。因此, 得出结论,miR-25 通过靶向 Pax3 促进 P19 细胞向心 肌细胞分化。 先天性心脏病的发生是一个复杂的过程。通过对 P19 细胞向心肌细胞分化进行研究,以期在细胞层面上 获得 miR-25 在 P19 细胞向心肌细胞分化中的作用及其 机制,为心脏发育以及先天性心脏病的防治提供新的线 索和理论依据。
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作者贡献:周静进行实验实施、数据统计,以及最终
成文、修改,张保朝进行实验设计、实施和评估并对文章 审校。

利益冲突: 所有作者共同认可文章有无相关利益冲突。 伦理问题:没有与相关伦理道德冲突的内容。 文章查重:文章出版前已经过 CNKI 反剽窃文献检测
系统进行 3 次查重。

文章外审:本刊实行双盲外审制度,文章经国内小同
行外审专家审核,符合本刊发稿宗旨。

作者声明:文章第一作者对研究和撰写的论文中出现
的不端行为承担责任。论文中涉及的原始图片、数据(包括 计算机数据库)记录及样本已按照有关规定保存、 分享和销 毁,可接受核查。

文章版权:文章出版前杂志已与全体作者授权人签署
了版权相关协议。

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